石蜡切片与免疫组化方法.docVIP

石蜡切片步骤 取材：将目标组织样按要求修剪至一定大小。 固定：用10%的福尔马林溶液固定组织样4-6h。 脱水：梯度酒精 50% 2h 70% 2h 80% 2h 95% 2h 95% 2h 100% 40min 100% 40min 透明： 二甲苯Ⅰ 8min 二甲苯Ⅱ 5min （观察组织，透明度较好为宜） 浸蜡：（蜡温保持在60℃） 软蜡Ⅰ 50min 软蜡Ⅱ 50min 硬蜡Ⅰ 50min 硬蜡Ⅱ 50min 硬蜡包埋 切片： 组织化学切片 4μm 常规切片 5 烘片：65℃ 脱蜡至水： 二甲苯Ⅱ 5min 二甲苯Ⅰ 5min 梯度酒精至水 100% 3min 100% 3min 95% 3min 95% 3min 80% 3min 70% 3min 50% 3min 染色： 1.常规HE染色 苏木素 10min 自来水洗 5min 盐酸酒精分化 10s 自来水洗返蓝 10min 伊红 1min 自来水洗 5mins 蒸馏水 1mins 免疫组织化学染色 抗原的修复：柠檬酸缓冲液95℃。time 消除内源性过氧化物酶：3%的H2O2的甲醇溶液孵育3min。PBS（10mM磷酸钠，150mM的氯化钠，pH7.4）洗涤3*3min 封闭：5%BSA封闭30min。洗涤3*3min 加生物素标记的凝集素：用生物素标记的凝集素溶在大约2-20μg/ml（梯度稀释的以找到最合适的浓度）的PBS中，加在切片上然后在室温下孵育30min。TPBS洗涤3*3min。1h混合ABC ABC试剂孵育30min。（现配）TPBS洗涤3*3min。 加辣根过氧化物酶标的亲和素：加在切片上后在室温下孵育30min。 TPBS洗涤3*3min。 显色DAB：含3%的H2O2的DAB显色10min。TPBS洗涤3*3min。结合镜下观终止反应，蒸馏水冲洗。 苏木精衬染 10min 蒸馏水洗涤 5min 盐酸酒精分化 10s（视颜色而定） 自来水返蓝 4min 梯度酒精脱二甲苯水透明封片 光镜下染色计数，清洁，封片。 梯度酒精脱水： 50% 2min 70% 2min 80% 2min 90% 2min 95% 2min 100% 2min 100%