基因扩增技术(PCR)要点详解.pptVIP

Polymerase chain reaction又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，在模板DNA，引物（模板两端的已知序列）和四种脱氧核苷酸存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。 PCR技术是由Cetus公司和加利福利亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为Kary B mulis和HeneryA、Erlich。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，能检测每10万个细胞中仅含一个靶DNA分子的样品。因而发明人Kary B、mulis获1993年诺贝尔化学奖。 PCR的种类 RT-PCR 反向PCR 不对称PCR 多重PCR 巢式RT-PCR 实时定量荧光PCR PCR温度循环参数 变性(denature)温度和时间 模板DNA的变性：模板DNA双链在93-96加热2’-10’解离；经 PCR扩增形成的双链DNA在93-96°C 加热30”-1’。 退火(anneal)温度和时间: Tm-5°C 温度降至55C左右，特异引物与模板DNA单链配对结合。 延伸(extend)温度和时间： 72°C 1000碱基/分钟 在TagDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模 板，引物为起始点，按碱基配对原理合成一条新的复制链。 循环数 在25~30个循环内，扩增的DNA量增加明显，然后进入平台期。 靶序列的初始浓度越低，所需循环数越高。 PCR扩增效率（理论） 以上三步为一个循环。每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，从理论上讲，每经过一循环，样本中的DNA量应该增加一倍，扩增DNA产量是以指数形式上升的，既n个循环后，产量为2n，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。 PCR扩增效率（实际） PCR反应体系组成 （1） DNA模板 （2） 引物 （3） dNTP （4） 耐热的DNA聚合酶 （5） 10×PCR缓冲液(含Mg++) 模板核酸 PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。 RNA的扩增必须经逆转录成cDNA后才能进行正常的PCR循环，称为RT-PCR。 PCR反应中模板加入量一般为102-105个拷贝的靶序列。 人工合成的寡核苷酸-引物 PCR扩增产物的特异性和扩增片段的大小是由引物限定的，因此，引物的设计对PCR的成功与否有决定性的意义。 引物设计原则：软件+经验 引物长度以15-30个碱基为宜； 引物碱基尽可能随机分布，G+C含量宜在45~55%左右； 引物内部不应形成二级结构； 两个引物之间不应形成二级结构； 引物与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性； 两个引物的Tm值要尽可能接近。 一般PCR反应中引物的终浓度为0.1-1?mol/L，在此范围内产物量基本相同。引物浓度低于0.1?mol/L时，产物量降低；引物浓度过高会引导非特异产物扩增，还会增加引物二聚体的形成。 合适的缓冲体系 目前最常见的缓冲体系为10~50mmol/L Tris-HCl(pH 8.3-8.8, 20℃)。Tris是一种双极性离子缓冲液，其主要作用是维持碱性的Taq酶作用环境。在缓冲液中加入明胶或无核酸酶的BSA，对酶有一定的保护作用，Tween-20(0.05%-0.1%) 及5mmol/L的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用。尤其在扩增长片段（延伸时间长）时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。 Mg2+ Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的。Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性、引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体的形成等等。因为，PCR反应混合物中的DNA模板、引物和dNTPs的磷酸基团均可与 Mg2+结合，降低 Mg2+的实际浓度。Taq DNA聚合酶需要的是游离的 Mg2+，因此，PCR中的 Mg2+的加入量要比dNTPs的浓度要高0.2-2.5mmol/L。最好对每种模板DNA, 每种引物都进行 Mg2+浓度的优化。 三磷酸脱氧核苷（dNTPs） 四种三磷酸脱氧核苷（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，工作浓度应为20~200?mmol/L。所用的四种dNTP的浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。dNTPs浓度过低则反应速度下降，dNTPs浓度过高则扩增特异性降低，而且当dNTP浓度高于50mM时也会抑制Taq DNA聚合酶的活性。 耐热DNA聚合酶 Taq聚合酶是从耐热菌（thermus aquatious）中提取出来的耐热酶，95℃仍有活性。该酶的应用浓度一般为1~2.5U/100?L反应体系，然而，酶的用量可依据不同的模板分子或引物而变化。酶浓度过高时，