基因诊断病原学要点详解.ppt

点击图片即可进入相应内容 病原体（pathogens） 指可造成人或动物感染疾病的微生物 * 点击“三个人”图片返回目录 (a)解旋(b)复性(c )核酸探针碱基配对(d)形成可检出的双螺旋片段 点击房子返回 * 点击右上图片返回 临床上有下述几种情况只能用基因诊断方法而不能依赖于免疫学诊断技术: (1) 结果不明或与临床不符 (2)使用疫苗或特异性抗血清治疗或免疫后的病例, 用免疫学指标已经不能反映病原体感染的程度; (3)大部分病原体可以整合入细胞内成为整合型, 免疫学方法只能测其细胞外表型; (4)供血员——配合PCR 方法可提高筛选试验的可靠性; (5)某些病原体感染后, 特异抗体的产生并不意味着临床恢复及感染消失。 点击右上角小人返回 * 点击右上图片返回 其实应用前面讲了蛮多。。。 * 不返回 基因与免疫方法互补 基因诊断 —病原学中的原理及应用  by PBL 3 1、简介 2、原理 3、特点 4、应用 5、发展 6、局限 基因诊断 —利用分子生物学技术， -从DNA/RNA水平检测基因的存在 -分析基因的结构变异和表达状态 -对疾病作出诊断 核酸分子杂交 PCR扩增 DNA序列测定 DNA芯片技术 病原体（pathogens） 能引起疾病的微生物和寄生虫的统称。微生物占绝大多数，包括病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体和真菌；寄生虫主要有原虫和嚅虫。 什么是病原体基因诊断？ 病原体的基因诊断：针对病原体自身特异性核酸（DNA或RNA）序列，通过分子杂交和基因扩增等手段，鉴定和发现这些外源性基因组、基因或基因片段在人体组织中的存在，从而证实病原体的感染。 2、原理 -分子生物学技术： 分子杂交：检测特定序列 PCR：扩增外源性DNA DNA测序 -病原体检测方法 用已知核酸探针确定单链核酸碱基序列的技术。 Southern 印记杂交 Northern 印记杂交 斑点杂交 原位杂交 分子杂交（molecular hybridization） probe probe 在有核糖体的病原体中： rRNA数量DNA 故直接测定核糖体RNA PCR扩增 1.不同种的微生物的DNA分子有可变区（绿色）和保守区（红色） 这是一段病原体DNA的示意图 2. 不同菌种间高度可变区是鉴别证据 可变区两端具有保守序列 3.根据此保守序列，设计广谱PCR引物扩增的片段，对高变区扩增 primer1 primer2 4. 引物扩增的片段经测序，并与基因库中序列比较就可得出待测细菌的菌种 一些病原体检测方法 (一)直接显微镜检查 (二)病原体分离、培养和鉴定 局限：适用于无菌，灵敏度低，分辨率低，耗时 局限：适用于易培养的微生物，耗时 (三)病原体抗原检测 抗原 抗体 抗原 抗体 S 局限：昂贵，存在正常菌时的交叉反应需对照 (四)病原体抗体检测 抗原 抗体 抗原 抗体 S 局限：敏感性（阴性值）特异性（阳性值）难定 ·主要技术为PCR -高度特异性 -高度敏感性 -快速检测已知DNA序列的 病原微生物 ·发展而来DNA芯片技术用于微生物的侦查检测，对病原体分类和分型。 3、特点 分离培养—周期长，操作繁杂，制约因素多 eg: 结核分枝杆菌 (1)培养：1～2个月 有合适引物，PCR检测、测序：1d (2)检测敏感度 ZN染色：27．7％ 培养：1 9．9％ 电镜观察—直观快速，但昂贵 免疫学诊断—简便快速，但存在问题： 不易检出潜伏期的病毒 有些病毒亚型多，抗原变异性大 整合进入人基因组的病毒 eg：麻风病 组织活检抗酸染色镜检：阳性率低 传统病原学检验法 3、特点 病原学基因诊断的优势： 1.快速检测出病原体 -确定感染源 2.快速分型 -明确病原体致病性或者药物敏感性 3.可鉴定需要复杂培养条件或不能体外 培养的病原微生物 3、特点 最成功的例子： 小亚基(16S )rRNA基因测序为基础的微生鉴定系统 16SrRNA基因序列资