苹果酸-乳酸酶基因克隆 其在酿酒酵母中表达.docVIP

Oenococcus oeni苹果酸－乳酸酶基因克隆 及其在酿酒酵母中的表达* 中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(12):50～55 刘延琳1蒋思欣2何秀萍2李华1张博润2** （1 西北农林科技大学葡萄酒学院杨凌7121002 中国科学院微生物研究所北京100080） 摘要苹果酸－乳酸酶是苹果酸－乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌SD2a的苹果酸－乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上, 以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件，以大肠杆菌－酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒并转化酿酒酵母YS58。酵母转化子用SD/Ura平板筛选鉴定。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中, SDSPAGE检测表明获得的转化子表达了约60kDa的目标蛋白。获得的转化子在添加了L苹果酸的培养基中培养4d；取培养液上清用HPLC检测L苹果酸及L乳酸含量，采用t检验进行差异显著性分析，结果表明mleA基因进行了功能性的表达，将L苹果酸转化成L乳酸，L苹果酸和L乳酸含量分别与对照差异极显著和显著，苹果酸的相对降低率平均为20.95%。 在有选择压力条件下，重组质粒相对稳定，而在无选择压力条件下，传代培养10d后大约有65%的重组质粒丢失。 关键词酒酒球菌苹果酸－乳酸酶基因转化表达 收稿日期：20050802修回日期：20050909 *陕西省自然科学基金及西北农林科技大学青年学术骨干支持计划资助项目 ** 通讯作者，电子信箱：zhangbr@sun.im.ac.cn葡萄酒的酿造包含酒精发酵和苹果酸－乳酸发酵（malolactic fermentation, MLF）两个生化过程,分别由酵母菌和乳酸菌在不同条件下完成。由于葡萄酒乳酸菌是在高酒精含量、低pH值及存在有SO2的环境中生长繁殖，MLF的过程往往比较缓慢，常出现迟滞现象，甚至引发微生物病害［1~3］。如果能把乳酸菌参与MLF过程的基因通过遗传转化导入酵母菌中，使酒精发酵和MLF由重组酵母单独完成，则可减少细菌引发的葡萄酒酸败，避免乳酸菌在MLF过程中产生不必要的代谢副产物，缩短葡萄酒的酿造周期。 苹果酸－乳酸酶（malolactic enzyme, MLE）是MLF过程中降解苹果酸的功能酶［1,3］。不同来源的苹果酸－乳酸酶基因在酿酒酵母表达研究［3~11］取得了一些进展。酒酒球菌（Oenococcus oeni）是优良的葡萄酒乳酸菌，关于O. oeni苹果酸－乳酸酶基因（mleA）的克隆及转换酿酒酵母的研究报道只有1例［3］，且表达的效率较低。本研究进行我国自行筛选的优良酒酒球菌菌系SD2a的mleA基因的重组表达质粒的构建及其在酿酒酵母中的转化和表达，进一步探索提高酿酒酵母重组菌株降酸效率的途径。 1材料与方法1.1材料 1.1.1菌株与质粒大肠杆菌DH5α、酿酒酵母YS58（MATα,ura3，trp1，leu2，his4）、质粒YEp352（amp，URA3，YeastE.coli穿梭载体）、pVC7276、pEA1（YEp352：：TADHI，何秀萍构建）、pLmleA（YEp352：：mleA，刘延琳构建），均由作者所在实验室保存。 1.1.2工具酶、抗生素及试剂RNase购自华美生物工程公司； T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自宝生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶、氨苄青霉素购自北京鼎国生物技术发展中心。分析纯L苹果酸购自北京化学试剂公司，色谱纯L苹果酸和L乳酸均购自Sigma公司。 1.1.3培养基及培养条件 大肠杆菌DH5α保存和培养用LB培养基，加入氨苄青霉素、IPTG和Xgal的LB培养基用于筛选重组转化子［12］，37℃静置或振荡培养；酿酒酵母完全培养基为YEPD培养基，转化子用含有色氨酸、亮氨酸、组氨酸的YNB选择培养基［13］进行筛选鉴定，28℃静置或振荡培养。 1.1.4引物根据已发表的酒球菌mleA基因的核苷酸序列［3］，设计相应的寡核苷酸引物P1/P2进行目的基因的PCR鉴定。下划线处分别是引入的EcoRI和KpnI酶切位点。P1：5′CGGAATTCATGACAGATCCAGTAAGT AT3′;P2：5′TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT3′；以上引物均委托上海生工公司合成。 2005, 25(12)刘延琳 等：Oenococcus oeni苹果酸－乳酸酶基因克隆及其在酿酒酵母中的表达 中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.12 2005 1.2方法 1.2.1基因操作质粒抽提、酶切反应、DNA片段回收、连接反应、细菌转化等操作均参照“分子克隆