植物组织培养第五章花药和花粉培养分析报告.pptVIP

第二节 花粉小孢子发育途径 离体培养条件下，花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝分裂，在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，把花粉形成植株的途径称为“花粉孢子体发育途径”。 目前，习惯把小孢子或花粉沿孢子体途径发育成花粉植株的过程称为“雄核发育”。 一、活体小孢子发育途径 花粉发育时期对诱导雄核发育是极其重要的。花粉母细胞经减数分裂形成四分体，有多种模式，以四面体和等二面体最普遍。 体细胞组织分泌出胼胝质到四分体表面，花粉四分体的胼胝质壁溶解并释放出四个小孢子。此时，小孢子细胞质浓厚，中央有一细胞核。 当液泡发生时，小孢子体积迅速增加，细胞核被挤向一边。在第一次有丝分裂时，小孢子核产生大而疏松的营养核和一个小而致密的生殖核，形成两个精子，它们处在花粉或花粉管中。小孢子从里到外被绒毡层、中层、药室内壁和表皮包围着。 二、离体小孢子发育途径 （一）雄核发育途径 离体培养时，尽管雄核发育可在四分体时期和双核花粉期被诱导，但最适宜诱导的时期是第一次有丝分裂或之前。小孢子在培养过程中呈现不同的发育模式。 目前，一般根据小孢子第一次有丝分裂情况将雄核发育分为A途径（不均等分裂）和B途径（均等分裂），其中A途径又根据第二次分裂及其以后的情况细分为A-V途径、A-G途径、A-VG途径（E途径）及C途径。 1、A途径 小孢子的第一次有丝分裂按配子体方式进行，为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞（或营养核和生殖核），这种途径又可细分为以下几种途径： A-V途径：多细胞花粉（多核花粉）由营养细胞重复分裂衍生而成，生殖细胞以游离核的形式存在一个周期后退化，或分裂一至数次后存在于多核花粉的一侧，有的甚至到球形胚形成时仍存在。因此，生殖核并不参与花粉孢子体的形成，在花粉中往往可以观察到生殖细胞的存在。 1、A途径 A-G途径：生殖细胞进行多次分裂形成胚状体，营养细胞不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结构。由生殖细胞形成的细胞群其核致密，染色后着色较深，容易同营养细胞衍生而来的细胞群区分开来。 A-VG途径：花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂，形成两类细胞群，各群的子细胞都类似其母细胞 ` 1、A途径 C途径：在获得的花粉植株群体中，除单倍体外，常有相当比例的二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体等非单倍体植株，即小孢子培养过程中自发加倍现象。此途径中，生殖核与营养核共同参与了花粉植株的形成。 ` 2、B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个大小相近的细胞（或游离核）。以后，由这两个细胞连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。 （二）雄核发育的启动机理（不讲） 三、花粉植株形态发生方式 如果不考虑小孢子核的早期分裂行为，花粉植株的形态发生有两种途径，即胚状体发育途径（直接发生途径）和愈伤组织发育途径（间接发生途径）。 三、花粉植株形态发生方式 （一）胚状体发育途径 小孢子的行为与合子的一样，经历了如同活体条件下诱导胚发生的各个阶段。 （二）愈伤组织发育途径 与胚状体发育途径相比，小孢子没有经历胚发生阶段，而是分裂数次形成愈伤组织，从花药壁上冒出来。 将小孢子从花药里游离出来的主要方法有： 1)自然散落法 合适的花蕾消毒后→无菌条件下取出花药→接种在预处理液或培养基→花粉囊自动裂开→小孢子散落到培养基中→收集小孢子→用新鲜培养基培养。 2)挤压法 ①挤压法 消毒处理过的花药→置与无菌培养皿或烧杯中→加少量提取液→用注射器内管或一端压扁的玻璃棒轻压花药→花粉挤到提取液中→级联过筛→除去组织碎片→低速离心→沉淀→清洗几次→制成小孢子悬浮液用于培养。 ②研磨过滤收集法。与上法相似，区别是把消毒过的花蕾置与无菌的研钵中研磨，挤出小孢子。 3)机械游离法 ①磁搅拌法 将花药接种盛有培养液或渗透压稳定剂的三角瓶→放一根磁棒→置磁力搅拌器低速旋转至花药透明。 ②小型搅拌（超速旋切）法 4)小孢子分离和纯化 小孢子匀浆→ 过筛→离心收集 花粉培养方式 1）平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养，诱导产生胚状体，进而分化成植株。 2）液体培养 花粉悬浮在液体培养基中进行培养。 3）双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。 4）看护培养 配制好花粉粒悬浮液和琼脂固体培养基后，将完整的花药或花药的愈伤组织放在琼脂培养基上，将圆片滤纸放在花药或愈伤组织上，然后将花粉置与滤纸的上方。 5）微室培养 将花粉培养在很少的培养基中。 做法：①琼脂培养基②液体培养基 6）条件培养基培养 在预先培养过花药的液体培养基中或在加入失活的花药提取物的合成培养基中，接入花粉进行培养。 三、移栽驯化 花粉植株非常娇嫩，很难移植。需采取逐步过渡