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功能检测 核酸酶分析检测。向细胞内共转染一对sgRNA来调解基因组的（微小）缺失或倒置，我们可以用核酸酶分析检测或测序检测插入缺失突变。我们的在线CRISPR设计工具为两种处理方法提供了推荐引物。然而，检测和测序的引物也可以手动设计，用来扩增基因组DNA中感兴趣的范围。传统的引物都是利用国家生物技术信息中心（NCBI）primer-BLAST中选择，用以避免非特异性扩增。 检测引物应该设计以扩增Cas9靶序列两侧的个200-400bp的碱基（总的扩增产物为400-800bp），这可以通过凝胶电泳清楚的看到切割片段。为避免过多引物二聚体的形成，检测引物应设计成典型的18-25nt长，变形温度大约为60℃。为分析鉴定或序列分析，我们推荐对每对候选引物产生的一个单一PCR产物进行测试，也要测试检测核酸酶消化过程中缺乏的非特异性切裂反应 质粒或ssODN调解的HDR HDR能够通过PCR扩增检测到，随后进行修改区域的测序或者对限制性片段长度多态性的分析。为达到这些目的，PCR引物应该使同源臂跨越区域之外的部分进行退火，以避免对剩余修复模板（HDR-Fwd引物和HDR-Rev；表1和图6a）的错误检测。对于ssODN调节的HDR，检测PCR引物可能会用到。WT Cas9核酸酶或者突变的Cas9核酸酶可以用于调解HDR,虽然后者的催化效率会因细胞类型有很大的变化。 通过测序检测插入缺失或HDR 靶基因组的修饰可以通过Sanger或深测序检测。对于前者，修饰区域的基因组DNA可以通过检测或HDR引物得到扩增。扩增产物应该亚克隆进入质粒，例如pUC9，进而转化，单克隆产物应该进行测序以揭示该克隆的基因型。 深度测序适合于大量的样品或靶位点。新一代测序技术（NGS）的引物为较短的扩增产物所设计，通常在100-200bp范围内。为检测非同源末端连接的突变，设计从Cas9靶位点开始至少50bp的引物是很重要的，这也允许我们检测更长的插入突变。对于由重sgRNA调解的更大的删除，引物的起始位点应设计在要删除区域之外。我们为两步PCR融合方法提供了参考，为多重深度测序添加上标记的测序适配器。针对它通常发生的低水平的假阳性插入缺失，我们推荐Illumina公司的平台。由于均聚物高的测序错误率，Ion Torrent不太适合对插入缺失的分析。NGS的最优化和故障诊断的详细的描述可以在Illumina公司的用户手册中查到。脱靶插入缺失的分析能够通过read-alignment程序执行，例如ClustalW、Geneious或简单的自定义序列分析脚本。 应用 自2014年以来，CRISPR/Cas9系统的开发和应用已成为分子生物学的热点。CRISPR/Cas9技术已在细菌、果蝇、哺乳动物、斑马鱼和人多能干细胞( human pluripotent stem cell，hPSC)基因的功能性研究中得到应用。Zhang等用CRISPR/Cas9对疟原虫基因进行了修饰，并介绍了一种对P.yoelii基因进行高效、准确敲除的方法。Gokcezade G等证明了在果蝇中通过双顺反的Cas9/sgRNA表达载体介导的CRISPR基因编辑是一种高效通用的方法，并通过单一质粒注射达到很大程度节省时间。Ho TT等通过敲除人体不同细胞中的非编码RNA，如mir-1，mir-29a，IncRNA-21A，UCA1和AK023948。证明了通CRISPR/Cas9可以成功敲除人类细胞系中非编码的基因 目前随着CRISPR/Cas9技术日渐成熟，为基因疾病的治疗提供了更方便、高效的工具。Lin SR等为证明CRISPR/Cas9系统是否能断裂HBV基因组，他们设计8个可识别A基因型乙肝病毒的gRNA，伴随gRNA的CRISPR/Cas9系统可以减少HBV病毒的核心复制和蛋白质的合成，其中一个gRNA可以打靶不同基因型的HBV病毒，最后通过感染的HBV小鼠模型，更加证明了系统可以清除体内HBV病毒，结果可以降低血清中抗原水平。 自第一只基因敲除小鼠模型的产生，科研工作者致力于模型生物的构建，但传统的构建方法费时费力，程序繁琐，新一代的CRISPR/Cas9技术为构建模式生物提供了新的平台。 Edvardsen R B等在大西洋鲑鱼中通过CRISPR/Cas9系统靶向修饰tyr和slc45a2基因，第一次成功地在冷水海洋物种中运用CRISPR/Cas9成功靶向诱变，并成功获得突变的等位基因，证明了F0代可用于大西洋鲑鱼的功能性研究。Irion U等在斑马鱼中成功利用CRISPR/Cas9获得功能缺失的等位基因。通过CRISPR/Cas9高效而且准确的靶向识别修饰alb基因上的终止密码子，突变率达到50%并可以通过生殖细胞遗传给下一代，为遗传研究提供了生物模型 Martin 等