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生物技术大实验实验指导 ——原生质体的制备、再生 一、实验名称：原生质体的制备、再生 二、实验目的：通过本实验掌握丝状真菌原生质体制备和再生的技术和原理，并能将该技术应用于育种和遗传研究。 三、实验原理： 微生物的细胞或菌丝在细胞壁被脱去或降解后所形成的圆球体，称为原生质体。真菌细胞壁的主要成分为己糖或氨基己糖构成的多糖链，如几丁质、脱乙酰几丁质、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。此外，还有蛋白质、类脂、无机盐等。所有真菌的细胞壁都具有无定形的和纤维状的组分。纤维状的组分包括几丁质和纤维素，都是由多聚物形成的微纤丝。无定形的组分包括蛋白质、甘露聚糖和?-(1,3)、和?-(1,6)、?-(1,3)葡聚糖，常混杂在纤维网中，但大多数真菌，包括子囊菌、担子菌、半知菌类和低等壶菌的细胞壁由几丁质（?-1,4-N-乙酰氨基葡糖为单元的无支链多聚体组成）。细胞壁的成分随真菌类群的不同而变化，并且每种菌体的细胞壁在其生活周期的过程中也存在差异。 最早的脱壁方法是用机械的方法剥离细胞壁来制备植物细胞的原生质体。1960年前后开始有大量关于用酶法制备植物和微生物原生质体的报道。此后虽然也有人尝试过用物理方法（如研磨和超声波等）制备原生质体，但远不如酶法普遍。酶法制备原生质体最关键的是根据不同物种的细胞壁的结构及其化学组成选用具有不同酶活性的脱壁酶。 真菌原生质体以广泛地应用于原生质体融合育种，质粒、线粒体等外源DNA的原生质体转化，细胞壁的重建以及生理生化研究等方面。因而，无论在理论上还是在应用上，原生质体的研究均引起了人们的浓厚兴趣。近几年来，真菌原生质体的研究对象已从实验室模式种逐渐转向具有工业价值的生产种，以期获得更好的经济效益。 四、材料 1、菌种：蛹虫草拟青霉。 2、培养基： （1）菌丝生长培养基 PDA培养基：马铃薯20 g（去皮切片煮沸30 min，过滤去渣）；葡萄糖2g；琼脂1.5g；蒸馏水100 ml；自然pH。 （2）再生培养基 再生基本培养基（低渗）： PDA（1.5 %琼脂） 再生培养基（下层）： PDA（1.5 %琼脂） 再生培养基（上层）：分别用0.6 mol/L 蔗糖、0.6 mol/L 葡萄糖、0.6 mol/L NaCl 、0.6 mol/L MgSO4四种渗透压稳定剂+再生基本培养基+1.0 %琼脂 3、试剂配制 （1）渗透压稳定剂配制： 0.6 mol/L MgSO4 : 7.22 g MgSO4, 100 ml水。101 kPa, 121℃高温灭菌20 min。 （2）酶液配制 1.0 g/100 ml Cellulase: 0.03 g 酶，3ml 渗透压稳定剂溶液0.6 mol/L MgSO4。酶液过滤除菌。 （3）100ml无菌水 五、实验步骤 1、菌种培养：将实验用菌种转接PDA斜面，25℃恒温培养7~10天；（每组转接2~3支斜面） 2、制备孢子悬液：用适量无菌水（含有0.05 %的Tween80）洗下斜面孢子，转入带有玻璃珠的小三角瓶中，充分振荡打散，制成均一的孢子悬液，血球计算板计数。直接使用或加甘油至终浓度15 %（v/v），-70℃保存备用。 3、制备菌丝体——玻璃纸平板培养法制备菌丝体：取200ml孢子悬液涂布于表面覆盖有一层玻璃纸的PDA平板或沙氏琼脂平板上，于30℃培养48~72 h, 刮下并收集菌体。（每组涂布3个平板） 4、制备原生质体：取100 mg制备好的湿菌丝体，加入3 ml酶液，30℃，60 r/min轻轻振荡酶解2 h。然后将酶解液于6层擦镜纸过滤，加入等体积（约3 ml）预冷的0.6 mol/L MgSO4洗涤残渣一次。两次滤液混合，轻轻颠倒混匀，4℃，4000 r/min离心10 min。弃上清，取沉淀即原生质体。用3 ml预冷的0.6 mol/L MgSO4重悬原生质体，制备得原生质体液。 5、原生质体再生：稀释原生质体液至104个/ml，取0.1ml原生质体液涂布在双层培养基（下层培养基7ml，上层培养基15ml）上或混菌，25℃恒温培养3~4天，菌落计数，取平均值。（每组涂布、混菌分别6个平板） 6、对照：稀释原生质体液至104个/ml，取100ml原生质体液涂布或混菌于低渗再生培养基，3平行，25℃恒温培养3~4天，菌落计数，取3平行平均值。（每组涂布和混菌各3个平板） 7、计算再生率： 再生率=（B-C）/A X 100 % A：原生质体数（个/ml）； B：原生质体在高渗再生培养基上的再生菌落数（个/ml）； C：原生质体在低渗培养基上的再生菌落数（个/ml）。 六、主要药品及耗材 主要药品： Cellulase、葡萄糖、无水MgSO4、蔗糖、琼脂 主要耗材：50ml三角瓶（每组3个），培养皿（每组20套），2