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IMAU, Huo XW 高等植物遗传转化系统 农杆菌介导转化方法 直接转化（理化法） 病毒感染 病毒载体介导的植物遗传转化 植物病毒可以感染植物寄主细胞，并进行复制和表达植物外源DNA。利用植物病毒的特性有希望发展成为一种有价值的植物遗传转化体系。 优点： 部分植物病毒对寄主的感染是系统性的，可扩散到寄主所有细胞，故无需组培再生； 可对单子叶植物进行高效浸染； 病毒感染的植物能够繁殖大量病毒颗粒，有望大量生产外源蛋白。 缺点： 目前对植物病毒分子生物学研究十分初浅，还不能建立有效遗传转化体系。迄今为止，植物病毒载体尚未发展到可以广泛使用的阶段。 重组双子座病毒载体系统感染植物示意图 高等植物细胞直接转化法 基因枪转化法 电击法 生殖细胞原位转化法（花粉管通道法） 显微注射法 激光微束穿刺法 PEG介导法（化学共培法） 一 基因枪转化法 又称微弹射击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道微靶点射击，将载有外源DNA的金属（钨或金）经驱动后通过真空小室进入靶组织的一种遗传转化技术。 采用的基因枪分为火药引爆、高压放电、压缩气体等。 1987年美国康奈尔大学的Sanford首次用于植物遗传转化。可用受体范围广泛，单、双子叶植物均可，许多单子叶植物遗传转化的主要方法。 基因枪价格昂贵，转化成本较高，轰击过程对细胞损害较大，转化效率有待进一步提高。 二 电击法 又称电击穿孔法，80年代发展起来的遗传转化技术，利用高压放电产生的脉冲使细胞膜产生可逆的“微孔”，从而使外源DNA等进入细胞。 最早应用于原生质体，近来有直接转化带壁植物细胞核组织的报道。 国际公认的一种成熟可靠转化法，对受体无限制，可用于胚性愈伤组织、悬浮细胞、分生组织、器官等。但需对转化参数进一步优化，转化效率低。 三 生殖细胞原位转化法 植物生殖细胞指雌雄配子体中形成的或参与生殖过程的有关细胞，如大小孢母细胞、卵细胞与花粉。生殖细胞原位转化法利用天然繁殖过程为转化系统进行遗传转化。 1 花粉管通道法：周光宇（1981）首先提出，之后有不少改良。使子房预先充分授粉，在授粉后至合子分裂之前，通过花柱断面滴加或子房注射，使外源DNA到达培囊，搜集成熟种子，筛选转基因植株。我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株， 2 花粉介导法：收集成熟花粉，基因枪等转化花粉，后用转化后的花粉授于成熟的柱头上，最后搜集成熟的种子。 优点：避开组织培养再生的过程，技术简单，不需要装备精良的实验室，适合于难以再生的植物，常规育种工作者易于掌握 。 缺点：技术尚不成熟；筛选工作量大，转化效率较低。 四 显微注射转化法 利用显微装置将大分子物质（DNA）或细胞器注射到培养细胞中。最初主要由于动物，80年代中后期开始用于植物遗传转化。用微毛细管在显微镜下将外源DNA导入特定细胞，并使其成活、增殖。 技术要点：注射针直径要细（1uM）;选择生长旺盛的胚性细胞；注射细胞核；进行微培养法。 优点：可精细选择受体细胞，并直接导入细胞核。 缺点：工作效率低，需要特殊显微操作系统，操作复杂。 五 激光微束穿刺法 利用激光微束（0.3-0.5uM）射击靶细胞，引起可逆性穿孔，从而直接导入外源DNA。首先在动物与人的细胞中获得成功，80年代后期用于植物。 技术原理：激光照射系统产生高能量激光脉冲，照射经高渗处理的材料，产生穿孔后，外源DNA向靶细胞渗入。然后培养靶组织，产生转化植株。 优点：可瞄准靶细胞定位导入外源DNA，与其他方法比较对靶细胞损伤小、恢复快。单、双子叶植物均可，受体细胞可以是花粉、单细胞或组织、器官。 缺点：需要相应昂贵的设备，穿刺处理速度较慢。　 六 PEG介导法 PEG为化学渗透剂，通过改变细胞膜的通透性促使外源DNA进入靶细胞。所引起的膜透性可以恢复，但引起的外源DNA进入机制尚不清楚。 技术原理：首先获得原生质体，并有相应的组培再生体系。在一定渗透压体系内将外源DNA直接导入。改进的方法有（1）脂质体法，将外源DNA与脂质体（磷脂双分子膜）的复合体用于转化；（2）电击法与PEG法相结合等，可提高转化效率。 特点：由于原生质体及相应的组培体系的获得较难，且培养周期长、细胞遗传背景易变异，故PEG法使用日趋减少。 基因枪及动力源的类型 火药爆炸轰击载体 塑料子弹为载体，火药爆炸为动力，挡板阻挡塑料载体，而金属子弹高速轰击靶细胞。 压缩气体冲击载体 以压缩氦气动力，可裂膜携带微弹高速运动，以阻网阻挡可裂膜，微弹轰击靶细胞。 高压放电基因枪 高压放电使水气化产生动力，驱动微弹载体。 压缩气流直接传送 以氦气动力直接驱动微弹。 微靶点射击 无需载体