缓冲液配制重点分析.doc

分子生物学常用试剂配置 2009-11-18 10:08 一、分子生物学常用贮存液的配制 1、30%丙烯酰胺溶液 【配制方法】将29g丙烯酰胺和1g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml.用滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0,置棕色瓶中保存于室温。 【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。 一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。 在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。 2、40%丙烯酰胺 【配制方法】把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L. 【注意】见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。 3、放线菌素D溶液 【配制方法】把20mg放线菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1:10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD440值。放线菌素D（分子量为1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为 21,900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182,放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20℃。 【注意】放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。 药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。 4、0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液 【配制方法】在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH调至pH值至7.0,用蒸馏水定容1ml,分装成小份保存于-70℃ 5、10mol/L乙酸酰溶液 【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。 6、10%过硫酸铵溶液 【配制方法】把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4℃保存数周。 7、BCIP溶液 【配制方法】把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃ 8、2×BES缓冲盐溶液 【配制方法】用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N,N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室温下用HCl调节该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20℃。 9、1mol/L CaCl2溶液 【配制方法】在200ml蒸馏水中溶解54g CaCl2·6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃。 【注意】制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml,用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷至0℃。 10、2.5mol/L CaCl2溶液 【配制方法】在20ml蒸馏水中溶解13.5g CaCl2·6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。 11、1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液 【配制方法】用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。 【注意】DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。 12、脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液 【配制方法】把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris碱分别调节每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH试纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度 计算出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP,分装成小份贮存于-70℃。 碱基 波长（nm） 消化系数（ε）[L/（mol·cm）] A 259 1.54×104 G 253 1.37×104 C 271 9.10×103 T 260 7.40×103 比色杯光径为1cm时，吸光度=εM。 13、0.5mol/l EDTA（pH8.0）溶液 【配制方法】在80