生物《基因工程的基本操作程序》解析.ppt

基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序 主要是编码蛋白质的结构基因 缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，热稳定DNA聚合酶，存在于缓冲液中，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 * 思考:转基因抗虫棉的大致培育过程? 一、目的基因的获取 二、基因表达载体的构建 三、将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 现代获取方法： 1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、化学方法人工合成 初始目的基因的来源 从生物中直接获取 人工合成 外显子 内含子 与RNA聚合酶结合位点 编码区 非编码区 非编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶结合位点 编码区 原核生物基因 真核生物基因 1、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 基因文库 基因组文库 部分基因文库 (CDNA文库) 某生物体内全部DNA 许多DNA片段 受体菌群体 1、从基因文库中获取目的基因 限制酶 与运载体连接 导入 基因组文库 某种生物某个时期的mRNA cDNA 反转录 受体菌群体 与运载体连接 导入 部分基因文库 （cDNA文库） 2、利用PCR技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。 循环 变性 退火 延伸 Taq DNA聚合酶的应用 高温解决了打开双链的问题，但又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活，促成了PCR技术的自动化。 PCR的反应过程 1、PCR的反应步骤 　　PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸 ①变性（模板DNA解旋） 　　模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解链，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。 2、循环过程 靶序列 靶序列 PCR 循环第一步：高温变性 ②复性（退火）—— 低温复性 　　模板DNA经加热变性成单链后，温度降低，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 ③延伸 —— 中温延伸 　　DNA模板－引物结合物在Taq DNA聚合 酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为 模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制 的原理，合成一条新的DNA链。 靶序列 靶序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸 1,048,576 20 1,073,741,824 30 8 3 4 2 2 1 DNA数量 循环次数 3、30次循环后靶序列扩增的数量 二.基因表达载体的构建-----------核心 基因表达载体的构建过程 质粒 DNA分子 限制酶处理 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 一个切口 两个黏性末端 复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因 基因表达载体的组成 三、将目的基因导入受体细胞 转化 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞----农杆菌转化法 转化 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 转化 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 2.将目的基因导入动物细胞 显微注射技术 提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵 受精卵移植 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 转化 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 2.将目的基因导入动物细胞 显微注射技术 3.将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理 *