实验二原代细胞培养精要.pptVIP

一、实验目的 了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。 组织培养细胞 上皮细胞(epithelial cells – adenovirus) epithelial cells - respiratory syncytial virus 成纤维细胞- herpes simplex virus 成纤维细胞- poliovirus  应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个或数个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，通常可使其贴附于玻璃瓶壁上，并生长增殖。 使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 1、血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清2、血清的处理 无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。 3、血清的作用 七、操作步骤 取胚（1，2） 剪胚（3，4） 消化（5，6，7，8） 分散培养（9，10） 1．取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。2．无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。 3．用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。 4．将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。 5．将剪碎的组织块倒入大青霉素瓶中，加入5ml DMEM，振摇后静置几分钟，吸弃洗液；如此重复1次。6. 加5ml胰酶，在37℃水浴中消化20-30min，5~8分钟摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。 7．消化好后，取出瓶子，静置几分钟，吸弃胰蛋白酶液。8. 加DMEM生长液5ml，轻轻摇动几次后，静置几分钟吸去。如此重复一次（目的是洗去残余的胰蛋白酶和抑制其消化作用）。 9．加入生长液5ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置3~5分钟，使未消化好的组织块下沉。 10．轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每瓶约1-2ml，补加DMEM生长液至10ml，使细胞量约为4-6×105个/ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。 11. 细胞计数方法 取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。 按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。 每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。   八、实验结果（鸡胚成纤维细胞） * * 实验二 原代细胞培养 （以鸡胚成纤维细胞为例） 上皮细胞 成纤维细胞 slides from CDC uninfected early infection late infection slides from CDC uninfected respiratory syncytial virus slides from CDC uninfected early infection late infection slides from CDC uninfected early infection late infection slides from CDC 二、原 理 三、材 料 1、9-10日龄鸡胚2、照蛋灯与蛋座3、碘酊棉球与酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小镊子5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶 6、 0.25%胰酶、DMEM培养液 生长液：含10%犊牛血清的DMEM培养液 维持液：含5%犊牛血清的DMEM培养液 四、细胞培养的条件要求 1）细胞密度 原代细胞：4-6×105个/ml 传代细胞：2-3×105个/ml2）pH范围：最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度 五、胰酶的作用机制 六、血 清 提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子 补充基础培养液中没有或量不足的营养成分 促进细胞贴壁 提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等 中和毒性物质 良好的缓冲系统 提供蛋白酶抑制剂 4、应用血清存在的问题 血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。 不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定，影响对结果的分析。 取 胚 剪 胚 消 化 消 化 分 散 培 养