实验一细胞及组织培养的准备工作精要.pptVIP

思考题 1.哪些物品适用于湿热灭菌？那些不适合湿热灭菌？ 2.D-Hanks液在细胞培养中的作用有哪些？ 预习下节课内容 * * 细胞及组织培养的准备工作 实验内容介绍 实验一、细胞及组织培养的准备工作 实验二、培养基及胰酶的配制 实验三、细胞的传代（I）与冻存 实验四、细胞复苏及细胞鉴别与计数 实验五、细胞原代培养 实验六、细胞传代（II）细胞爬片 实验七、细胞骨架组分的荧光染色观察 实验八、考试——动物细胞培养技术 实验内容介绍 实验九、动物细胞的转染与GFP的RNA干扰技术 实验十、利用MTT比色法测定细胞群体的相对细胞数 实验十一、探究实验（综合设计实验） 实验十二、探究实验（综合设计实验） 实验十三、扫描电子显微镜简介 实验十四、扫描电子显微镜生物样品制备及观察 课程要求 一、遵守实验室的各项规定 二、仪器使用要遵守操作规则 三、上课不迟到、不早退、不无故旷课 四、上课时必须穿实验服 五、服从研究生助教的指导和安排 六、按时完成作业 七、保护实验环境、爱护实验动物 八、实验结束后，及时清理实验用品 实验考核方式 平时成绩 60 %，期末考试40 %平时成绩：课堂操作，实验习惯，合作精神， 实验报告，课堂互动期末考试：组织培养技能考核：辨认细胞 实验操作 总结报告：自主创新实验收获 科研小论文 实验一、细胞及组织培养的准备工作 一、实验原理 1.体外培养（in vitro culture) 的基本概念: 将活体结构成分（甚至个体）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。按照体外培养的结构成分，可将体外培养人为地分为： 组织培养（tissue culture） 器官培养（organ culture） 细胞培养（cell culture) 一、实验原理 组织培养(Tissue Culture)是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在模拟体内生理环境下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 细胞培养(Cell Culture)是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 器官培养（Organ Culture） 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。 一、实验原理 2. 组织细胞培养的优点 能够长时间观察细胞的生命活动 容易控制实验条件，有利于生物学研究 容易直接采集细胞及亚细胞结构的图象 便于各种细胞染色处理和标记 培养细胞的单一性，有利于排除干扰因素 一、实验原理 3. 体外培养技术的应用： 基础研究：细胞生物学乃至整个生命科学研究中最基本的实验技术之一。被培养的组织或细胞是良好的实验材料。细胞培养广泛应用于现代医学和生物科学研究之中 生产实践：疫苗生产、药物研制与肿瘤防治等医学实践提供了全新的手段。 一、实验原理 4. 细胞及组织培养的基本条件 （1）无污染的环境条件 （2）适当的温度:由酶和蛋白质所需要的最适温度决定,35－37℃(人和哺乳动物细胞) （3）气体环境与pH环境： pH7.2-7.4 (人和哺乳动物细胞) （4）营养条件 （5）其它条件：等渗条件、附着底物 一、实验原理 5.无污染的环境条件 凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染。 （1）细胞污染的种类 A.物理污染:  *温度: 解决对策： 孵箱放在温度较恒定的房间中培养液从冰箱取出后在室温放置 *放射线与辐射:解决对策： 试剂周围不能放同位素尽量不放在带有玻璃门的冰箱中 *振动:解决对策：孵箱周围不能放引起振动的设备 *其他：尘土、玻璃残渣等.解决对策：严格清洗 B.化学污染 水: 解决对策：用双蒸和三蒸水配液和清洗容器 （现在用纯水仪millipore超纯水） 容器: 生产过程中有毒物质残留（铅、砷）;消毒剂和清洗剂的残留;铝箔和包裹纸残留 解决对策：培养用各种器皿的严格清洗（泡酸） 培养箱:CO2混有有毒气体; 消毒剂和清洗剂的残留 解决对策：购置高质量的CO2培养箱擦拭干净 一、实验原理 C.生物污染 细菌、霉菌和酵母:易被发现,易造成隐性污染病毒: 最难发现和清除,严格的宿主性,自限性支原体：污染严重,难发现 ,难清除原虫、昆虫：其它细胞系：解决对策：实验用品严格灭菌，无菌操作同一时间只传同一种细胞,每种细胞要有单独的液体。建立细胞库，每三个月更换一次细胞 一、实验原理 6.清洗与灭菌