第四章目的基因的制取解析.pptVIP

抗体鉴别阳性克隆 用专门设计的表达载体，将真核基因编码的蛋白质在大肠杆菌中实现表达，通过免疫化学法进行检测。 差示杂交 需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针（或以相应的cDNA作探针)平行杂交，对有表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆文库进行筛选。 差别杂交的局限性： 1.杂交灵敏度低，对于低峰度的mRNA尤为明显。 2.工作量大，重复性差，两套平行滤膜之间的DNA保有量有差别，导致杂交信号不一致。 DNA的化学合成 寡核苷酸单链的化学合成 探针的化学合成 连接子和接头的合成 基因的半合成 全长基因化学合成 三 化学法合成目的基因 DNA的化学合成法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法、寡核苷酸连接法等，现在常用的是固相亚磷酰胺法，使用全自动合成仪，将一个不同的单核苷酸按照需要连接起来再经脱保护处理、纯化，获得一个特定的DNA片段。 这种方法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。 方 法 磷酸二酯法 亚磷酸三酯法 寡核苷酸连接法 磷酸二酯法 磷酸二酯法的基本原理：将二个分别在5′-或3′-末端带有保护基的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸。 具5′保护的单核苷酸，便能够通过它的3′-OH 同另一个具有3′保护的单核苷酸的5′-P之间定向地形成一个二酯键 一端脱保护的二核苷酸分子，如带5′保护的二核苷酸分子，又能够同另一个带3′-保护的单核苷酸分子进行第二次缩合反应，形成一个三核甘酸分子。 亚磷酸三酯法 原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的 寡核苷酸连接法 化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp，而绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因。常用的基因组装方法主要有种 第一种方法是带上5’-磷酸基团寡聚核苷酸，与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，再用T4DNA连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。 第二种方法是将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段，可经处理插入适当的载体上。 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 限制化学法合成基因的因素 ①已知序列且有应用价值的基因很少，而植物来源的基因更少； ②化学合成的寡核苷酸片段长度有限，经基因组装才能合成较大的目的基因，而这往往使基因制备难度加大； ③化学基因合成相比之下比较昂贵。 四、 PCR制备目的基因 （1）目的基因的直接克隆 适当的引物，PCR基因扩增法可以产生μg级的特异的靶DNA片段，达到这种数量级的基因组DNA可以直接克隆到相应的载体（如质粒或者M13载体，如pMD18-T）中。 （2）cDNA的克隆 利用PCR技术，只需增加一步逆转录反应，便可从少数的mRNA构建cDNA文库。以mRNA为模板，以oligo（dT）为引物，在依赖于RNA的DNA聚合酶催化下体外合成cDNA第一链之后，可通过PCR扩增此链。 pMD18-T PCR技术在分子克隆中的其它应用 （1）生成可用作探针的DNA片段 如上所述，只需增加一步逆转录反应，利用PCR可以快速有效地合成大量从cDNA产物，这些产物即可克隆于适当的载体，也可以作为探针用于Southern或Northen印迹杂交或用于筛选cDNA与基因组DNA文库。此外利用PCR可以生成大量克隆化双链DNA中的特定序列作为探针。 （2）染色体缓移-反向PCR PCR通常用于扩增位于两寡核苷酸引物之间的DNA区段，但是经特殊设计的PCR也可用来扩增那些位于已知序列外侧的序列，这就是反向PCR。 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 反向PCR可利用与靶序列5′端互补的寡核苷酸引物，对靶序列两侧未知的DNA序列进行扩增。 还可以迅速产生合适的杂交探针， 用于鉴定DNA文库中与靶序列邻近的或重叠的DNA片段的克隆。这一种方法称做染色体缓移（chromosome crawling）。 （3）不对称的PCR与DNA序列分析 PCR方法可以用于合成Sanger法测序模板： 一是使用两种过量的引物扩增待测的DNA序列，然后用凝胶电泳的方法纯化DNA扩增产物，用作Sanger法测序的模板。 二是采用带有由噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子的引物作测序PCR。 * 1