第四章柠檬酸发酵微生物及发酵机理解析.ppt

柠檬酸生物合成的理想途径 由葡萄糖发酵柠檬酸的理想途径，即葡萄糖生成柠檬酸的碳平衡和能量代谢如图： C6H12O6 EMP 途径 2×C3H4O3 丙酮酸脱羧 CO2固定 C4﹒C2缩合 C6H8O7 柠檬酸 丙酮酸 H2O 2ADP 2ATP 2H2 H2 9ADP 9ATP 3/2O2 3H2O 以上过程总反应式为： 理论转化率：106.7% C6H8O7·H2O理论转化率：116.7% （一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节 1、磷酸果糖激酶调节 正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶（PFK）有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。 二、柠檬酸生物合成的代谢调节 淀粉 葡萄糖 6-磷酸果糖 1，6-二磷酸果糖 磷酸丙糖 磷酸烯醇丙酮酸 丙酮酸 乙酰CoA 草酰乙酸 柠檬酸 CO2 CO2 CO2 NH4 + Pi K + AMP ATP 2.Mn2+调节 比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉合成代谢的酶受损伤，这与柠檬酸的积累有关。 锰缺乏时，可导致细胞内NH4＋ 浓度增高，并出现某些氨基酸的积累.因为Mn2+是催化核酸合成的酶所必需的。Mn2+ 的不足能影响某些蛋白质、核酸的合成，使NH4＋浓度升高，从而解除柠檬酸和ATP对PFK酶的抑制作用并使EMP代谢流畅通，丙酮酸和草酰乙酸水平升高，而使柠檬酸大量积累，这就是锰离子的调节效应。 3.丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。 4、丙酮酸羧化酶的调节 丙酮酸是真菌糖代谢的一个重要分叉点，丙酮酸既可以由丙酮酸脱氢酶催化脱羧生成乙酰CoA,也可以由丙酮酸羧化酶催化经CO2固定反应生成草酰乙酸，CO2固定强度对柠檬酸积累非常重要。保持丙酮酸这两个反应的平衡是获得柠檬酸高产率的一个重要条件。 （二）TCA循环的调节 1、TCA循环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点。 顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活。 黑曲霉线粒体中顺乌头酸酶在催化时，能建立下面的平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7，这个平衡可造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低，从而抑制顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶的活性，就抑制了柠檬酸自身的进一步分解。 2.第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低时，TCA循环在此被阻断。α-酮戊二酸脱氢酶的合成被葡萄糖和NH4＋阻遏。α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆的反应。 磷酸烯醇丙糖酸 丙酮酸 乙酰CoA 苹果酸 草酰乙酸 柠檬酸 顺乌头酸 异柠檬酸 α-酮戊二酸 琥珀酸 富马酸 CO2 Fe 2+ CO2 CO2 抑制 α-酮戊二酸脱氢酶系 3.氧对柠檬酸发酵的影响 乙酰CoA和草酰乙酸缩合生成柠檬酸过程中要引入一个氧原子，因此氧也可作为柠檬酸生物合成底物。而当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会影响酶的活性，从而导致柠檬酸产酸急剧下降。所以柠檬酸发酵过程中，特别是产酸期，一定要供给充足的氧，以提高柠檬酸产率。 TCA循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为： （1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键 （2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及其微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力。 （3）TCA循环的阻断微弱，导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。 柠檬酸的积累机制归纳： ①Mn 抑制蛋白合成 NH4 解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径的畅通 有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链 ② 由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，就可以源源不断地提供草酰乙酸。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定反应取平衡，保证前体物乙酰CoA和草酰乙酸的提供，柠檬酸合成酶基本上不受调节，增强了合成柠檬酸的能力。 2+ ﹢ 缺乏 ③α-酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏，使黑曲霉中的TCA循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱TCA循环，降低细胞内ATP浓度，另外使α-酮戊二酸浓度升高。反过来，又反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解； ④由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以