第三章微生物细胞的破碎解析.ppt

三．超声破碎法 (Ultra sonication) 超声破碎也是应用较多的一种细胞破碎法，通常采用的超声破碎机的工作频率为15~25kHz。 超声破碎机理---超声波引起空穴现象 在相当高的输入声能下，液体各个成核部位会形成许多小气泡。在声波膨胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压缩，直到不能再压缩时，气泡破裂，释放出猛烈的震波。于是，大量声能被转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细胞破碎。 在用于细胞破碎的容器中，流体动力学按照完全混合方式，则蛋白质释放动力学遵循一级反应定律： 1 – x = exp （-kt） (3-4) 式中x为释放蛋白质的分率； k为蛋白质释放常数，min-1； t为超声波发射时间，min。 超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。 对不同菌种的发酵液，超声破碎的效果差别较大。一般地，杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞比革兰氏阳性细菌细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。 采用超声破碎法处理少量样品时操作简便，液量损失少，因而在实验室规模应用较为普遍。 超声破碎法的优点 超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却剂进行冷却。但在大规模操作中，声能传递和散热均比较困难。 此外，超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活，因而有一定的局限性。 超声破碎法的缺点 四．X-press法 X-press法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。 此法主要用于实验室，具有适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但该法不适用于对冷冻敏感的生化物质。 3.2.2 非机械法 许多非机械方法都适用于微生物细胞的破碎，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、热处理、化学法溶胞等，其中有些方法的应用是有限制的。 一．酶溶法(Enzymatic lysis) 酶溶法是利用酶反应分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。 酶溶法可分为外加酶法和自溶法两种。 1．外加酶法 常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等，而细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。 利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。 实例： 对酵母细胞采用酶溶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内物质。 外加酶法主要用于实验室规模，如利用酶溶法可从细胞内不同位置选择性地释放目的产物和制取特殊的胞壁葡聚糖聚合物等。 此外，酶溶法大量用来剥离细胞壁，将原生质体进行融合，这是细胞工程常用的方法。 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。 酶溶法的优点 1）溶酶价格高，限制了大规模应用； 2）酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确定最佳的溶解条件； 3）产物抑制的存在，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶，这是导致酶溶法胞内物质释放低的一个重要因素。 酶溶法的不足 2．自溶法 自溶法是一种特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身产生的。 控制一定条件，可以诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH、激活剂等。微生物细胞的自溶法常采用加热法或干燥法。 实例： 对谷氨酸生产菌，可加入0.028mol/L Na2CO3和0.018mol/L NaHCO3，配成pHl0的缓冲液，再配3％的细胞悬浮液，加热至70℃，保温搅拌20min，菌体即自溶。 1）对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性； 2）自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降。 自溶法的缺点 二．化学渗透法 (Chemical permeation) 某些化学试剂，如有机溶剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性(渗透性)，从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法。 1. 表面活性物质 表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。 Triton X-100是一种非离子型表面活性剂，能结合并溶解磷脂，因此其作用主要是破坏内膜的磷脂双分子层，从而使某些胞内物质释放出来。 2. EDTA螯合剂 EDTA螯合剂对革兰氏阴性菌细胞外层膜有破坏作用。 革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离