第三章植物基因工程技术及应用解析.pptVIP

基因工程的概念 基因工程（genetic engineering） 基因工程（gene engineering），又称为重组DNA技术，是按着人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组DNA,然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。 基因工程的基本特点:分子水平操作，细胞水平表达。 在这个过程中： 1.“基因剪刀” ——限制性核酸内切酶 2.“缝纫针” ——DNA连接酶 3.“交通工具”——载体 4.“乘客”——目的基因 二、植物基因工程中常用遗传转化的基因元件 1、目的基因 真菌和细菌： GUS、HPT、NPTⅡ、GNA均来自大肠杆菌；杀虫蛋白基因cry1Ab、cry1Ac、cry2A则来自苏云金芽孢杆菌；抗除草剂基因Bar来自吸水链霉菌。 病毒： 几丁质酶基因。 植物： 蛋白酶抑制基因、凝集素基因等、Xa21、C4相关基因、水稻中生产胡萝卜素—前维生素A的基因。 动物： 来自水母的绿色荧光蛋白基因（GFP）、蝎的昆虫毒素基因、蜘蛛毒素基因。 人工合成基因： Wx的反义基因。 2、选择标记基因 新霉素磷酸转移酶基因NptII：表达产物可以拮抗卡那霉素 、G418 潮霉素磷酸转移酶Hpt基因：表达产物可以抗潮霉素（Hygromycin B） Bar 基因：表达产物可以抗 PPT) 三、转基因的主要方法及原理 基因枪法（微弹轰击法） 基本原理：将DNA包被在微小的金粉或钨粉粒表面上，以火药爆炸、高压气体或高压放电等作为驱动力，将微粒射入受体细胞或组织，伴随伴随而入的DNA分子便随机整合到寄主细胞的基因组中，从而实现转化的目的。 优点： （1）直接将DNA送入完整的、可再生的植物细胞，避开了原生质体分离和再生的困难。 （2）靶细胞类型广泛，不受组织类型限制，几乎所有具有潜在分生能力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击转化。 （3）利用基因枪法可以同时将多个基因导入植物。 缺点： 易引起多拷贝插入和非孟德尔遗传，且外源DNA整合机理不清楚，随机性较大，目标基因与筛选标记基因有时发生重排，有益基因有可能丢失。此外，不同的受体类型，其基因枪转化参数需进行优化，且价格昂贵。 高压气体基因枪－PDS-1000/He PEG 诱导法 基本原理： PEG法借助化合物聚乙二醇、磷酸钙，在高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。 优点： 对细胞伤害小，转化顺利 实验成本低 受体植物不受种类限制 能够转化较大的外源DNA片段（甚至某物种的总DNA） 转化子易于筛选 结果较为稳定、重复性较好 易于推广等优点 缺点： 受体制备和保持比较困难 分化效率低，费工费时， 基因依赖性强，原生质体再生困难 再生植株结实率低，易产生突变体 电击（激）法 基本原理：利用高压电脉冲作用，在原生质体质膜上电击穿孔，形成瞬间可修复通道（一般只有8nm），当外源DNA附着于细胞质膜电击点时，DNA分子就有可能通过小孔进入细胞内，进而整合到受体细胞基因组上。 优点： 除具有PEG原生质体转化法的优点外，还具有操作简便、DNA转化效率高的优点。 缺点： 造成原生质体的损伤，使植板率降低 仪器比较昂贵。 “电注射”法，它可以直接在带壁的植物组织和细胞上打孔，将外源基因直接导入细胞。使用该技术可以不制备原生质体，提高了植物细胞的存活率，而且简便易行，现已有水稻上成功应用的报道。 花粉管通道法 基本原理：是利用植物受粉后一定时间内，外源DNA可通过花粉管渗入，经珠孔通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，进而借助天然的种胚系统（Germ line）形成转基因种胚。 优点： 在理论上可以应用于任何开花植物，不需离体再生过程 具有广泛的应用性，特别是对于一些其它转化条件不具备的实验室尤其值得尝试 操作简便 缺点： 无法提供令人信服的分子证据以及遗传分析数据 重复性也比较差 脂质体转化法 基本原理：是用脂类化学物质包被DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把脂体内的DNA转入受体细胞。 激光微束介导法 基本原理：激光经光学显微镜聚焦后，形成微米级的微光束，细胞经过这种微光束照射后，在细胞膜上可形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。 低能离子束介导法 基本原理：利用低能离子束的溅射，引起植物细胞壁刻蚀变薄并产生局部