第四章蛋白质化学第六节蛋白质及氨基酸的分离纯化与测定解析.pptVIP

* （五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法 亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。 亲和层析经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。 亲和层析最先用于酶的纯化并从中得到发展， 亲和层析（affiuity chromatography） 应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能 + 待纯化分子 配体 a. 理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性 + 基质 b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂 + + 杂质 c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离 + d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子 原理： 基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex 亲和层析原理示意图 蛋白质混合物 配体 与配体结合的蛋白质 加入的可溶性配基 专一性结合蛋白质 没有结合的蛋白质 非专一性结合蛋白质 蛋白质浓度 洗脱体积 与配体专一性结合蛋白质 加入配基 基质 * 四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 1.蛋白质的含量测定的方法 凯氏定氮法 双缩脉法 Folin一酚试剂法（Lowry法） 紫外吸收法染料结合法（Bradford法） 胶体金测定法 * 2.蛋白质的纯度鉴定 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法：电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。 目前采用的电泳分析有等电聚集、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和SDS - PAGE、毛细管电泳等。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳图谱只呈现一个条带（或峰）同样地，纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。由于沉降系数主要是由分子大小和形状决定的，而与化学组成无关，因此作为鉴定纯度的方法，它要比电泳分析差些。HPLG常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定。 * 一、一般原则及基本步骤 材料的预处理及细胞破碎 蛋白质的抽提 蛋白质的粗分级 等电点沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 蛋白质的细分级 凝胶层析法 离子交换层析法 亲和层析 第六节 蛋白质的分离纯化与测定 * 二、蛋白质的分离纯化方法 ◇（一）根据分子大小不同的纯化方法 ◇（二）利用溶解度差别的纯化方法 ◇（三）根据电荷不同的纯化方法 ◇（四）利用选择性吸附的纯化方法 ◇（五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法 * （一）根据分子大小不同的纯化方法 ◇ 1.透析和超滤 ◇ 2.密度梯度离心 ◇ 3.凝胶过滤 1.透析和超滤 半透膜袋 蛋白质溶液 透析液 磁棒 磁力搅拌器 透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜： ?玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper） ?火绵纸（赛璐玎纸, celloidin paper） ? 其他改型纤维材料 超过滤（ultrafiltration） 利用压力、抽滤（A）或离心力（B）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。 为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用截向流过滤的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。 滤膜 抽气 滤膜 离心 A B 2.密度梯度离心法（density gradient） 生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。 滴加样品 离心管 蔗糖密度梯度 蔗糖浓度 * 3.凝胶过滤 原理： 凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。 应用 测定分子量 * 分子