基因诊断分析.pptx

Department of Biochemistry and Molucular Biology;2;3;一、基因诊断的概念和特点;（二）特点;(三) 基因诊断方法和传统疾病诊断方法的区别; 核酸分子杂交技术 核酸扩增技术 DNA序列测定技术 单核苷酸多态性检测技术 生物芯片技术　　 蛋白质组学技术 生物信息学在分子诊断中的作用;杂交信号检测; （一）、核酸分子杂交 原理：核酸的变性复性理论。双链的核酸分子在某些理化因素（如高温等）作用下，双链解开，待条件恢复时，又按碱基互补配对规律形成双链结构。在这一过程中，不同来源的DNA（RNA）分子，只要具有部分互补配对的碱基序列，即可形成杂合双链。;; * 核酸分子杂交的分类： 1. 杂交发生的环境： 固相杂交：样品位于固相支持物上，与液相中的探针杂交 液相杂交：样品和探针在液相中杂交。 2. 杂交样品的位置： 核酸印迹杂交：Southern Blot, Northern Blot 斑点杂交（dot blotting）或狭缝杂交 原位杂交（in situ hybridization） 基因芯片;（一）核酸印迹杂交 一般步骤: 1. 探针的制备（标记） 2. 样品的制备 3. 电泳分离 4. 转膜 5. 杂交：预杂交——杂交 6. 结果检测 ;探针的制备（标记） 探针（probe）——用放射性核素或其他标记物标记的短的核酸片段（几十至几百核苷酸），它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用以检测核酸样品中的特定DNA或RNA。 种类：DNA, RNA, 寡核苷酸; 标记物： 放射性核素（同位素）：32P，3H，35S 生物素，地高辛，荧光素[如异硫氰酸荧光素(FITC) 等] 制备方法: （1）化学法 ：标记物分子活性基团与核酸分子上的基团发生化学反应； （2）酶促法：标记核苷酸（原料中的一种dNTP） ，酶促合成探针。 ;酶促法最为常见:;样品的制备： 组织中提取：基因组DNA用特定的限制性内切酶消化 细胞总RNA 基因文库 核酸混合物 3. 电泳分离：待测样品按照分子量大小分离，分子量marker DNA、 RNA : 琼脂糖凝胶电泳 RNA、蛋白质等: 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;4. 转膜 印迹（印渍）技??：将存在于凝胶中的生物大分子转移到固定化介质上并加以分析的技术。用于DNA、RNA、蛋白质的检测。硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜、PVDF膜等 (1) DNA印迹技术：Southern Blotting (2) RNA印迹技术： Northern Blotting,主要用于检测组织细胞中特定基因的表达（mRNA的存在） (3) 蛋白质印迹技术：Western Blotting 毛细管转移法，电转移法等;5.杂交 预杂交：封闭样品中非特异性的结合位点。鲑精DNA， 脱脂奶粉等 杂交：将探针溶于杂交缓冲液，膜浸于其中进行杂交 洗膜：缓冲液洗涤去除未杂交的探针。 6. 结果检测 同位素：放射自显影 荧光、化学发光：压X光片 生物素等：酶标亲和素——底物显色(ABC法) 地高辛：酶标抗体——底物显色(AP等) ; Southern blot 用于基因组基因的定性定量、基因突变和特定条件下获得的基因片段（酶切片段等）的分析。 注意事项： DNA样品的酶切,大片段脱嘌呤降解,电泳胶的处理(变性液), 膜上DNA的固定(干烤或紫外交联) ;Northern blot 用于特定基因表达的定性定量分析 注意事项： （1）去除RNA酶。玻璃器皿：烘烤、氯仿冲洗、DEPC水浸泡；溶液： DEPC水处理； （2）制备凝胶：含有甲醛等变性剂。MOPS + 甲醛。 （3）样品的处理（变性） ：甲酰胺或甲醛 （4）RNA电泳：18S和28S rRNA作为参照 （5）RNA的转移：NaOH浸泡和DEPC水冲洗去除甲醛。 ;Overexpression of sis and myc mRNA in CO8. Two micrograms of poly A+ (sis probe) and 20 μg of total RNA (myc and cdk4 probes) from each cell lin