酶的定向进化分析.ppt

酶法体外随机-定位诱变 　　为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题, 我们曾以类胰岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型, 探索了一种酶体外诱变的新途径, 即酶法体外随机-定位诱变(random-site-directed mutagenesis)〔29～32〕.　该方法的内涵与酶的体外定向进化类似, 对目的基因既采用随机突变增加突变位点, 以快速产生优质酶,又让其突变受到一定限制, 以减少筛选突变体的工作量. 实际上, 该法也是体外模拟自然进化. 不同点在于，通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配.　　从上述策略不难看出,随着分子生物学技术的发展, 可以更灵活、快速和简便地改造目的基因. 从功能出发, 先获得某优化的突变体, 一方面可快速将其推向应用, 另一方面将对蛋白质的理论研究起到更大的推动作用. 定向进化的筛选策略 琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。 微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。 微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。 突变体分离 通过酶促反应的特征 加入底物显色 荧光共振能量转移 同位素标记底物 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测 酶检测 信号探测 分光光度计和荧光酶标仪 气相色谱和高效液相色谱 质谱和核磁 通常, 筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关〔34，35〕. Venekei等人〔36〕报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变体的方法和最佳筛选条件, 主要是利用蛋白酶选择平板初选, 再配合活性染色（activity staining）和X-光片消化分析（X-ray film digestion assay）加以验证, 并检测其活力, 快速筛选了44 000个突变株.　　Roberts等人〔37〕用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强的抑制剂. 从含有4 900个突变体的基因库中，获得与该酶的结合能力高于野生蛋白质3.6×10 6倍的突变体, 比已报道的任何一个相应的抑制剂高50倍〔38〕.　　另有一些其他的筛选方法〔39，40〕, 如加入能产生可见光信号的底物〔17〕或利用绿色荧光蛋白的荧光性质 〔41〕等. 总之, 选择在酶的体外定向进化中至关重要,直接关系到其成败. 定向进化与自然进化的异同点 定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同： 进化动力不同： 保守突变 非保守取代； 进化方向不同： 适应突变的积累； 进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天； 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要 求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。 定向进化的优势、现状和未来 较之蛋白质分子的合理设计, 酶的体外定向进化属于非合理设计（irrational design）. 其突出的优点是, 不需事先了解酶的空间结构和催化机制. 它适宜于任何蛋白质分子, 大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围. 特别是它能够解决合理设计所不能解决的问题〔11，42～44〕，使我们能较快、较多地了解蛋白质结构与功能之间的关系，为指导应用（如药物设计等）奠定理论基础.此外,该技术简便、快速、耗资低且有实效. 总之, 酶的体外定向进化是非常有效的更接近于自然进化的蛋白质工程研究的新策略. 它不仅能使酶进化出非天然特性, 还能定向进化某一代谢途径; 不仅能进化出具有单一优良特性的酶, 还可能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加, 产生具有多项优化功能的酶，进而发展和丰富酶类资源; 完全在试管中进行的酶（或蛋白质）的体外定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年 〔10〕，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃. 目前，对一些酶（或蛋白质）(表1）、砷酸盐解毒途径〔45〕、抗辐射性 〔46〕、生物合成途径〔47〕、对映体选择性〔48〕、抗体库 〔49〕以及DNA结合位点定向进化〔50〕的可喜成果令众多的相关科学家为之振奋. 可见, 进化能发生在自然界, 也能发生在试管中，它与合理设计互补, 将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶（或蛋白质）分子, 将使蛋白质工程学更加显示出强大的威力和诱人的前景. 酶的体外定向进化应用实例 酶 性　　质 突变方法 参考文献 枯草杆菌蛋白酶E 有机相活性/稳定性 易错PCR 〔