01 质粒的提取.pptVIP

实验一质粒的提取（碱法） 实验目的 1.了解碱法提取质粒的原理； 2.掌握碱法提取质粒的方法。 实验原理 质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子载体。碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 载体结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制起点 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等 T-载体 在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。 本实验采用高纯质粒小量制备试剂盒（离心柱型）提取质粒。 本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 实验仪器、材料、试