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第十二章 灭菌 绝大多数工业发酵是需氧的纯种发酵，所以必须消除杂菌的污染。如果发生杂菌污染会产生以下不良后果： ①杂菌消耗基质和产物，造成产率下降； ②杂菌的代谢产物或染菌后发酵液的某些理化性质发生改变，使产物提取变得困难； ③污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败； ④污染杂菌可能会改变反应介质pH值，从而使生物化学反应发生异常变化； ⑤发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败。 控制有害微生物主要有以下几种措施 第一节 培养基和发酵设备的灭菌 主要介绍培养基的湿热灭菌 　　湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。蒸汽冷凝时释放大量潜热（l g 100℃的水蒸汽变成lg100℃水时，释放出2255.2J的热量），并具有强有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。 由于湿热灭菌有经济和快速等特点，因此被广泛用于工业生产。 用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求是: 既要达到一定的灭菌程度， 又要尽量减少营养成分的破坏。 一. 微生物的死亡速率与理论灭菌时间 杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时向称为致死时间。 微生物对热的抵抗力常用热阻表示。热阻是指微生物在某一种特定条件下（主要指温度和加热方式）的致死时间。一般说灭菌是否彻底，是以能否杀死热阻大的芽孢杆菌力指标。 理论灭菌时间 某些分子的分解和分子内部的重新排列的反应属于单分子反应。 细菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属与单分子反应，因此杂菌在一定温度下受热死亡也遵循单分子反应方程。 理论灭菌时间 反应速度常数与温度的关系可用阿累尼乌斯方程式表示： 由于杀死微生物的活化能E大于营养成分破坏的活化能E′，所以随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数，因而在较高温度下可以缩短灭菌时间而保留较多的营养物质。 如将芽孢杆菌和维生素B2放在一起灭菌的试验发现，当温度升至118℃，加热时间为15分钟，可杀死99.99％的细菌芽孢，维生素B2的破坏率为10％；而在温度120℃下加热1.5分钟，细菌芽孢的死亡率仍为99.99％，而维生素的破坏率为5％。 高压灭菌效果监测 1 高压蒸气灭菌指示卡：将卡片放入灭菌器不同部位，观察灭菌后指示卡颜色变化。 2 芽胞菌片法：将每片染有嗜热脂肪杆菌芽胞105cfu/ml的菌片包好、放入灭菌器内。灭菌后作细菌计数测定。 对照是不经灭菌的菌片，芽胞完全被杀灭或杀来率达99.9999％为合格。 二. 培养基的灭菌方法 1. 分批灭菌 培养基的分批灭菌就是将配好的培养基放在发酵罐和其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。 高压蒸汽灭菌设备 手提式灭菌锅，容量小，多用于母种培养基灭菌。 立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。 灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶 袋 。但投资太大，适合大型菌种场使用。 营养物质的破坏： 在培养基热灭菌时，不仅微生物会死亡，培养基中一些热敏性物质也会因受热而破坏。例如，糖溶液会焦化变色、蛋白质变性、维生素失活、醛糖与氨基化合物反应、不饱和醛聚合、一些化合物发生水解等等。 2. 连续灭菌 连续灭菌以“高温、快速”为特征，就是将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到灭菌温度（一般高于分批灭菌温度，130～140℃），短时间保温（一般为5～8 min）后，被快速冷却，再进入早已灭菌完毕的发酵罐。 一 连消系统 连续灭菌的设备流程图 二 热交换器的连续灭菌系统 连续加压灭菌法优点 ①因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比“实罐灭菌”（120℃，30分钟）提高产量5～10％； ②由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率； ③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率； ④适宜于自动化操作； ⑤降低了操作人员的劳动强度。 三 高温对培养基成分的有害影响及其防止 消除高温有害影响的措施 （1）采用特殊加热灭菌法 （2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并； （3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀； （4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌； （5）在大规