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原核表达法氏囊素
一 目的 通过引物扩增或者直接合成BS基因,并将BS基因串联,插入质粒进行表达,表达产物经胰酶消化,超滤纯化目的三肽。
二 材料
1 载体 pUC18、pET20b(+)
2 酶 Hind Ⅲ、Bam H Ⅰ、Bgl Ⅱ、T4 DNA连接酶。
3 工程菌 DH5α、BL21。
4 培养基 LB
5 抗生素 氨苄青霉素
6 诱导剂 IPTG
7 Ni -NTA His? Bind?树脂(试剂盒)
三 方法
1 技术路线
2 引物合成/目的基因合成
按大肠杆菌惯用密码子选择赖氨酸-组氨酸-甘氨酸常用密码子5’ -GGT- CAC- AAA-3’(即BS基因)。目的基因有两种方法合成一是引物合成,二是直接合成目的片段。
2.1 引物合成
2.1.1 BS合成引物设计(将5个BS串联):
p1: 5’-caagcttgggaagatcttctttgtgacc-3’
p2:5’-cgcggatccgggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaagaagatcttcccaagcttgg-3’
酶切位点:Bam H Ⅰ(ggatcc),Bgl Ⅱ(agatct),Hind Ⅲ(aagctt)
2.1.2 检测引物合成
pUC18-bs检测引物:与BS合成上游引物配对
p3 5’-tttacactttatgcttccggctcgtatgtt-3’
pET20b(+)-bs8检测引物:与BS合成上游引物配对
p4 5’-taatacgactcactatagggagaccacaacgg-3’
2.1.3 扩增片段
pUC18-bs1约180bp;
pUC18-bs2约234bp;
pUC18-bs4约342bp;
pUC18-bs8约558bp;
pET20b(+)-bs8约615bp。
2.2 直接合成目的基因
2.2.1 购买合成基因片段
5’-cgcggatccgggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaagaaga
3’-gcgcctaggcccagtgtttccagtgtttccagtgtttccagtgtttccagtgtttcttct
tcttcccaagcttgg-3’
agaagggttcgaacc-5’
2.2.2 检测引物设计
p1: 5’-caagcttgggaagatcttctttgtgacc-3’
pUC18-bs检测引物:与P1引物配对
p2 5’-tttacactttatgcttccggctcgtatgtt-3’
pET20b(+)-bs8检测引物:与P1引物配对
p3 5’-taatacgactcactatagggagaccacaacgg-3’
3 载体构建
3.1 构建pUC18-bs载体
3.1.1构建pUC18-bs1
将pUC18用Hind Ⅲ、Bam H Ⅰ进行双酶切,回收大片段;将目的基因片段用Hind Ⅲ、Bam H Ⅰ进行双酶切,回收大片段。酶切后的大片段产物进行连接,构建pUC18-bs1。将连接后载体转化至DH5α,在Amp+LB平板上挑取单克隆,同时进行酶切鉴定及PCR鉴定,PCR产物应为180bp。
3.1.2 构建pUC18-bs2
用BglⅡ、Bam HⅠ双酶切目的基因,回收大片段;用BglⅡ酶切pUC18-bs1,回收大片段,将酶切回收后的大片段进行连接,构建pUC18-bs2。将连接后载体转化至DH5α,在Amp+LB平板上挑取单克隆,同时进行酶切鉴定及PCR鉴定,PCR产物应为234bp。
3.1.3 按3.1.2方法分别构建pUC18-bs4(PCR产物应为342bp)、 pUC18-bs8(PCR产物应为558bp)等。
构建方法见下图。
3.1.4 pUC18-bs8载体表达序列
3.2 pET20b(+)-bs载体构建
将构建好的pUC18-bs8用Bam HⅠ、Hind Ⅲ进行双酶切,回收目的基因片段;用Bam HⅠ、Hind Ⅲ双酶切pET20b(+),并回收大片段;将两回收片段进行连接,构建成pET20b(+)-bs8载体。将连接后载体转化至BL21,在Amp+LB平板上挑取单克隆,同时进行酶切鉴定及PCR鉴定,PCR产物应为556bp。
构建方法见下图。
3.3 pET20b(+)-bs载体表达序列
3.3 预期电泳结果
将上述构建好的pUC18-bs1、pUC18-bs2 、pUC18-bs4、pUC18-bs8采用Bam H Ⅰ、Bgl Ⅱ进行双酶切,pET20b(+)-bs用Bam HⅠ、Hind Ⅲ酶切,并进行琼脂糖凝胶电泳。
4 转化表达
4.1 感受态制备
按常规方法制备感受态。
4.2 转化
将构建并测序正
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