吸附柱色谱分离技术分析.pptVIP

吸附柱色谱分离技术 柱色谱分离特点 柱色谱分离与薄层色谱类似，是靠洗脱剂把分离的各组分逐个洗脱下来的过程，故也称洗脱色谱。 由于色谱柱填充的吸附剂的量远远大于薄层板，因而柱色谱可用于分离量比较大（克数量级）的物质。所以作为较大量样品的制备分离，柱色谱优于薄层色谱。 * 色谱分离技术在药物研究中具有重要意义 吸附柱色谱分离原理 ?利用欲分离的混合物中各组分分配在固定相和洗脱剂之间，被吸附的性质不同，而相互得以分离。 ?化合物被吸附作用越强，该化合物溶解在洗脱剂中越少，沿洗脱剂移动的距离则越小。反之，越多。 常压柱色谱 装柱 上样 洗脱 合并 1.装柱 ?所用吸附固定相一般为硅胶，氧化铝，粒度要求100-160目或160目以上。 ?吸附剂粒度越小，分离度越大，但洗脱速度越慢。 ?Rf值相差较大时，应用硅胶100-160目，可上样30mg/g硅胶，更多的情况下硅胶量为10mg/g硅胶（即分离1g 样品需要100g 硅胶）。 ?应用氧化铝时，粒度要求100－150目，分离1g样品需要20－50g氧化铝。 (1) 干法装柱 在柱子上端放一漏斗，直接加入硅胶。轻轻敲打层析柱，或上下震动层析柱，使填装均匀，再加一层石英砂，然后加入洗脱剂，使硅胶润湿。必要时加压或减压以除去气泡，加速溶剂化速度。 (2) 湿法装柱 将吸附剂硅胶与一定量溶剂调成悬浆状，快速倒入柱管中，打开活塞，使溶剂慢慢流出，吸附剂慢慢下降而均匀沉入色谱柱底。吸附剂填料完毕,一般再覆盖0.5cm厚的石英砂。 2.上样 （1）样品能被流动相溶解 ?将其中极性溶剂尽可能的用旋转蒸发仪去除后， 加入少许流动相稀释。 ?待将吸附剂上面的多余洗脱剂放出，直到柱内液体表面降至石英砂表面时，停止放出洗脱剂。 ?将样品用滴管或漏斗沿柱子内壁直接加入柱中。 ?样品稀释要尽可能用少的洗脱剂，然后用最少量洗脱剂洗涤器皿与层析柱内壁，洗涤完毕，开放活塞，使液体渐渐放出，液面降至石英砂下端时，再加入流动相洗脱。 （2）样品不能被流动相溶解 ?可选择极性大的溶剂溶解。如氯仿，丙酮，乙醇，甲醇，四氢呋喃，吡啶，免用DMSO,DMF沸点较高溶剂。 ?再加入适量的硅胶于溶剂中（一份样品+ 约5份柱填料），用旋转蒸发仪减压蒸去溶剂至干，让样品均匀地涂布在固定相表面上，然后通过漏斗装于柱子上端。旋转蒸发时，一定要加防爆球，以防样品硅胶爆沸。 3.洗脱 （1）洗脱剂的选择应以TLC检测为依据。被分离物质的最佳Rf值应在0.2-0.5内。被分离的2个点之间△Rf值应尽可能的大，越大越好。 （2）洗脱剂应不断加入，保持一定高度。 （3）洗脱液收集洗脱液采用等份法收集。 （4）控制洗脱液流出速度。不能太快，一般以1-2滴/秒为宜。 4.合并 洗脱液按编号TLC点样展开，将Rf值相同者合并，浓缩，最后进一步纯化。 注意！ 1.吸附剂表面应尽量平整，并水平。 2.吸附剂充填时必须非常均匀，不可出现空气泡、隙缝等。 3.样品层应尽量薄。 干柱色谱 ?是指用填充剂干装成柱，然后进行层析分离的一种方法。实际上是制备薄层的一种改进。即由薄层板改为柱状，采用塑料薄膜或玻璃柱。 ?将吸附剂填充到塑料薄膜柱中，把欲分离混合物置于柱子顶端，加展开剂展开，当展开剂到达柱底部时即完成分离。用小刀沿着分离部位将柱子切开或将吸附剂推出，从分段的吸附剂中用溶剂提取所需的化合物。 1．吸附剂 ?常用氧化铝或硅胶为吸附剂。 ?一般干柱层析吸附剂粒度200～300目较好（硅胶），干柱色谱样品与吸附剂比例1：300～1：500。 2.装柱 ?与一般柱层析一样。 3.上样与展开： ?将混合物溶于展开剂中;或将样品溶于溶剂中，加入5倍量的吸附剂，在旋转蒸发仪上蒸干后。均匀地加载于柱子上端，上面再覆盖少量石英砂。加入展开剂，使柱的顶端保持有3－5厘米厚的液面。展开时展到柱子底端即可，然后去除色谱柱支撑物。 4检查与分离 ?按色带或紫外下的色带用小刀将柱子切开，将各段吸附剂分别放在索氏提取器中，溶剂提取。 快速柱色谱 快速柱色谱可克服普通柱分离的缺陷，它具有快速省时、分离效率高、简单易行的优点。对于0.01-10g的样品，Rf 值0.15的情况下，在10-15分钟可快速得到分离。 *