生化教案1.docVIP

实验一 还原糖和总糖的测定(3,5-二硝基水杨酸比色法 一、实验目的 1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理 2、学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来对还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成还原性单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量以葡萄糖含量计。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在50nm波长下测定，标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9 （ ） （DNS） （3—氨基—5—硝基水杨酸） 黄色 桔红色 三、实验材料和 1、实验材料 面粉1mg/mL葡萄糖标准液3,5-二硝基水杨酸DNS)试剂碘-碘化钾溶液酚酞指示剂6mol/L HCl；6mol/L NaOH；2mol/L NaOH。 2、实验 试管：15mm×180mm×12； 烧杯：100mL×6，500mL×1, 锥形瓶100mL×1； 容量瓶：100mL 吸量管：10mL×3，2mL×3，1mL×3； 恒温水浴锅 载玻片；玻璃棒；胶头滴管；分光光度计 漏斗；滤纸；试管架；擦镜纸；电子天平等。 、 1.样品溶液制作 （1）还原糖的提取 100mL烧杯准确称取g面粉，先用少量蒸馏水调成糊状，然后mL蒸馏水搅匀，置50℃恒温水中保温20min，并不断搅拌使还原糖浸出。L容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线作为还原糖待测液。 总糖的水解和提取 100mL锥形瓶准确称取g面粉，加15mL蒸馏水及10mL 6 盐酸，置沸水浴中加热水解30min用碘-碘化钾溶液检查水解是否完全，若溶液不变蓝色说明水解完全。待瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6NaOH溶液中和NaOH溶液至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中。过滤，取滤液10mL，移入mL容量瓶中定容， 2.制作葡萄糖标准曲线样品中还原糖和总糖的测定 取支试管编号，按表分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同反应液。 以为纵坐标，葡萄糖含量mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 试剂 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 还原糖 总糖 葡萄糖标准液mL) 0.0 0.2 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1.0 1.2 1.4 样品溶液（mL） 1.5 1.5 蒸馏水mL) 2.0 1.8 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.0 0.8 0.6 0.5 0.5 DNS(mL) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 葡萄糖含量mg) 0.0 0.2 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1.0 1.2 1.4 将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入16.5mL蒸馏水，摇匀。在λ=540nm处测定吸光度，注意用0号管调零。 λ=540处测定吸光度 五、结果与计算 还原糖% = 总糖% =×稀释倍数×0.9×100 式中，m1 为根据葡萄糖标准曲线中查出的还原糖或总糖的含量（mg）； m2为样品重量；1000为mg换算成g系数。 六、注意 1. 在称取面粉时，注意量程，烧杯、锥形瓶等不可用小量程天平称量。 2. 在还原糖提取步骤中的定容过程中，应沿壁缓慢加入蒸馏水，否则可能会使液面上产生大量气泡导致不易定容。 3.使用分光光度计之前要预热10-20min。 4.试管沸水浴后应先用流水冲洗再放入大烧杯中进行冷却，避免因温度变化 剧烈而导致试管炸裂。 [思考题]1、在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl处理？而在其测定前，又为何要用NaOH中和？ 2、 3、3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的 4、分析误差来源。 实验二 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、实验目的 掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测