2014.4.4免疫荧光技术实验.docVIP

免疫荧光技术实验的常用方法 免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )，又叫做荧光抗体技术，其主要的实验原理是抗原与抗体能够特异性结合，通过之间的化学反应使得标记抗体的荧光素显色来确定组织细胞内的目标抗原（多肽和蛋白质），并对其进行定位、定性及定量研究的一类方法，该技术也是标记免疫技术中发展最早的一种。 免疫荧光实验主要的实验步骤有三步：首先是抗原片的制作，接下来是试验类型，最后是荧光显微镜检查。抗原片的制作分为标本组织的制作和样品固定，试验类型分为直接法、间接法、补体结合法等。 其中细胞滴片的间接免疫荧光法属于免疫组化方法的一种，可用于抗体、抗原的定性、定量及定位检测，也是目前使用最为广泛的一种实验技术。从相关的文献中很容易找到其操作步骤，但是由于很多实验室的条件有限，通常实验无法正常进行。此外，其他的免疫荧光技术还有流式细胞仪、时间分辨免疫荧光技术、荧光偏振免疫分析技术、时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫分析技术等。 手机微信“扫一扫”，更多学术齐分享！ 免疫荧光技术实验过程中改进的小窍门 免疫荧光技术实验过程中往往对实验条件要求较高，所以在具体的操作过程中根据现有条件及实验要求对实验做一些改进、简化，既省力又省钱，同样可以达到预期效果。 该实验对玻片的清洁度要求很高，因此在玻片的选择和处理时要格外注意，只能使用干净的普通玻片或有凹孔的玻片。在用普通玻片制作细胞滴片时，通常需要采用盐酸浸泡、乙醇清洗处理等方法保证玻片的清洁。要使得细胞悬液在玻片上充分固定，需要用PBS缓冲液洗涤，只有这样样品烘干后才能显示印迹。当向印迹滴加试液和二抗后，伊文斯兰将样本染成肉眼可见的蓝色，荧光观察时也极易找准观察位置。当然，用专门进行免疫荧光操作的凹孔玻片效果更好，但是成本较高。 此外在粘片剂的使用方面，可以使用直接细胞滴片法代替蛋白甘油，直接滴片样本有较好的附着力，避免使用费劲的粘片剂，还能简化实验步骤、节省经费支出。为了避免玻片上的试液不会干燥，可以选择一个平整的试管架将玻片放在架上，再将其放入水浴锅中盖上盖子进行保温，方便有效。　　 手机微信“扫一扫”，更多学术齐分享！ 免疫荧光技术的主要实验类型　 免疫荧光技术实验类型主要有四种，下面按照其实验技术的具体细节及特点进行介绍： （1）直接法：将特异的荧光抗体直接滴加于标本组织上，使之与抗原发生特异性结合。该方法的优点是操作简便，特异性高，非特异性荧光染色因素少；缺点是敏感度偏低，实验步骤繁琐，每检查一种抗原就需要制备特定的荧光抗体。 （2）间接法：有两种抗体的相互作用，一抗为针对抗原的特异性抗体，二抗（荧光抗体）为针对一抗的抗体。该方法法可用于检测抗原和抗体，具有灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体的优点。 （3）补体结合法：该方法是在间接法的第一步加入补体，常见的如多用豚鼠补体，然后用荧光标记的抗补体抗体进行示踪。该方法的敏感度高，也只需要一种抗体。缺点是容易出现非特异性染色，此外补体存在不稳定的现象，制备起来较为繁琐。 （4）双标记法：采用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。 间接法是目前使用最多的免疫荧光技术，但是随着技术的进步，双标记法也得到了越来越多的应用。 手机微信“扫一扫”，更多学术齐分享！