肿瘤基因突变检测标本要求.ppt

不同类型标本处理方式 新鲜组织标本： 1、迅速低温放置，如有条件可放置-80℃或者液氮保存，如果没有条件可使用-20℃保 存，但是保存时间不宜太久； 2、放入组织保存液中保存，组织保存液的能渗透0.5cm厚度的组织，因此用组织保存液保存时，建议组织不宜过大。核酸在组织保存液中 37 ℃稳定存放1天，25 ℃稳定存放一周，4 ℃ 1个月或–20 ℃长期存放 石蜡组织标本 1、手术、穿刺、活检标本等放入10%中性福尔马林中固定后制作成蜡块，可保存数年之久。(病理科常规处理样本方式) 细胞学标本 1、胸水样本、心包积液、脑脊液等，建议在收到标本后两个小时内离心收集沉淀细胞进行检测，如来不及操作可离心后将沉淀冻存至-20℃保存，等使用时取出；亦可将沉淀包埋成蜡块后再切片检测； 2、或者将样本直接放置4℃保存过夜再离心收集沉淀，可能会一定程度影响DNA的完整性，但一般不影响实验结果。细胞学标本建议涂片后经病理诊断含有肿瘤后在进行检测。 血液标本 1、血液标本收集后使用EDTA抗凝，由于血浆、血清中游离核酸以及循环肿瘤细胞量极少，建议尽可能在收集标本后2小时内进行核酸提取，以避免核酸更深降解。 肿瘤基因突变检测标本 病理评估合格的 标本适用于EGFR 基因突变检测 建议采用灵敏度 高的ARMS检测 方法 用于突变检测的标本 1. Dacic S. Adv Anat Pathol 2008; 15(4):241-247. 2. Sequist LV, et al. Clin Cancer Res 2006; 12(14S):4403s-4406s. 3. Bai H, et al. J Clin Oncol 2009; 27(16):2653-2659. 肿瘤基因突变检测标本类型 冰冻组织 外科手术标本：最好标本，可得高质量肿瘤DNA 支气管镜、穿刺活检测标本：量少，但肿瘤DNA质量仍好 固定包埋组织 外科手术标本：可得足量肿瘤DNA，但DNA片段化 支气管镜、穿刺活检测标本：可得肿瘤DNA量少且片段化 细胞学标本 胸水、肺泡冲洗液和痰液标本：肿瘤细胞含量不确定，通常很少 血液标本 血清、血浆标本：含肿瘤DNA，但含量不稳定，DNA片段化 循环血肿瘤细胞：可得较高质量肿瘤DNA，但量很少 标本通常较大，能提供足够的肿瘤组织用于检测 标本可以是冰冻或福尔马林固定组织 手术标本 标本接收、固定 组织处理、石蜡包埋 切片及H&E染色 组织学观察 支气管镜活检 标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的ARMS检测方法 细针穿刺活检 标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的ARMS检测方法 细胞学标本 细胞学标本中通常肿瘤细胞数目较少，需要采用灵敏度高的ARMS检测方法 建议有条件的病理科制备细胞蜡块： 处理流程：细胞学标本经离心处理后，常规福尔马林固定、处理及石蜡包埋即可 制备细胞蜡块的好处： （1）便于长期保存；（2）方便用于EGFR基因突变的检测及其他分子生物学标记物的检测 胸水或支气管刷片或痰液 涂片、染色 病理诊断 液基细胞学 病理诊断 细胞蜡块，切片染色 病理诊断 四、胸水标本处理流程 收集胸水50-500mL 室温静置30分钟，吸去上清，剩余 5-50mL 沉淀物室温250g离心10分钟，吸去上清 低温保存 酒精固定涂片 福尔马林固定切片 福尔马林固定的标本 固定要及时，离体后即时处理<1h 固定液：10% 中性缓冲福尔马林（新鲜配制） 固定液的量：应为组织体积的10倍以上 固定时间：小组织6-12h，大标本6-48h 冰冻标本 组织离体后立即速冻<1h 标本的质量控制 肺转移性肝细胞性肝癌 未检测到肿瘤组织 病理评估不达标样本导致EGFR突变检测呈阴性结果 小细胞性肺癌 肿瘤细胞太少 4 例肺肿块切除标本EGFR突变检测呈阴性 Rubbish In; Rubbish Out 选择正确、合适的肺癌组织，是保证突变检测成功第一步及重要的步骤 诊断：确保肿瘤组织是非小细胞性肺癌 肿瘤量：确保有足够的肿瘤组织用于突变检测 尽量保证200-400个肿瘤细胞 对于技术成熟的实验室，可以尝试进行<200个肿瘤细胞的标本检测 5-10uM 10张切片能满足突变检测需求 当细胞数较少时,可以适当增加切片数,以满足检测需求 肿瘤比例：标识肿瘤丰富的区域，提高肿瘤细胞比例用于检测 尽量去除非肿瘤组织及细胞，提高检测的敏感性 不同敏感性的检测方法对肿瘤比例要求不一样 测序法：〉10% ARMS法：〉1% 标本的病理评估内容 肿瘤组织是EGFR突变检测的最适标本。肿瘤组织标本包括冰冻组织和固定包埋组织。