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引 物 设 计 引物 引物的重要性 引物种类 简并引物设计步骤与原则 引物与PCR 引物（primers) 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 → ← 3’ 3’ 5’ 5’ Sense primer Antisense primer 引物的重要性 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。 引物种类 特异性引物 针对某一序列设计的引物，往往是固定的。 简并引物 多用于随机扩增，在引物的某个位置上，可以是A\T\C\G中的任意值，随着简并系数的增加，随机性也增加。 密码子 简并引物设计原则 从蛋白到核酸， 请注意：1) 尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区，如蛋氨酸和色氨酸仅有一个密码子。2) 充分注意物种对密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。3) 引物不要终止于简并碱基，对大多数氨基酸残基来说，意味着引物的3末端 不要位于密码子的第三位。 4) 在简并度低的位置，可用次黄嘌呤(dI)代替简并碱基。　 总的原则为： 尽量降低引物的简并度，尤其在3末端 或 近3末端 一、利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列 因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。 二、对所找到的序列进行多序列比对 同一种基因在不同物种会表达不同的氨基酸序列，将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，找出保守序列。 可选工具有Clustal?W，也可在线分析http://www.ebi.ac.uk/clustalw/。 三、确定合适的保守区域 ?设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。 引物长度 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。 上游：5-GGKLNRG-3 （70） 下游： 5-KTAYYSFY-3（230）全长160 序列480bp 翻译成DNA 上游：5-GGNGGNAARYTNAAYMGNGGN-3 下游：5-AARACNGCNTAYTAYWSNTTYTAY-3 反义链：5-RTARAANSWRTARTANGCNGTYTT-3 氨基酸序列转DNA序列 五、对引物的修饰 简并引物的简并度：＜500 若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3?则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度过高，不利于pcr。 其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝A／T，H＝A／C／T，B＝C／G／T，V＝A／C／G，D＝A/G?/T, N=A／C／G / T）， 我们可以通过用次黄嘌呤代替N和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度 上游：5-GGNGGNAARYTNAAYMGNGGN-3 下游：5-RTARAANSWRTARTANGCNGTYTT-3 简并度：16843 3896 上游：5-GGYGGHAARYTSAACCGYGGY-3 下游：5-GTAGAANGAGTARTAKGCVGTCTT-3 简并度：192 48 修饰 引物3’端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。 引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 kozak序列：在酶切位点与上游引物之间，加Kozark sequence(GCCACC)是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的AUG环境，避免ribosome（核糖体）出现leaky scan 引物的内