现代分离技术讲述.ppt

④分析型色谱— 线性色谱：柱子不过载。样品组分的保留值（K′）和柱效（η）不随样品量的变化而改变。K′与流动相相流速无关，分离度（Rs）和塔板数（n）与流速有关。峰形与样品量无关，但峰面积与样品量成正比。 制备色谱—有两种情况。一是柱子不过载，与分析型色谱有类似的现象；二是柱子过载，这就是非线性色谱。在柱子过载后， K′、n随样品量的变化而变化（样品量增大，K′减小,n增大)。流速对分离度和塔板数的影响较小。 ⑤分析型色谱不收集组分洗脱液，制备色谱中要收集有关产品的洗脱液。 （3）不同混合样品的制备方法 在制备色谱中，主要考虑：保证产品纯度、降低消耗。在一个混合样品中，需要制备的组分常有如下三种情况，并应采取不同方法分离制备。如图7-9。 欲分离制备组分 是一个主要组分 欲制备组分 有两个主组分 被制备的组 分是微量组分 图7-9 制备色谱中被制备组分的三种组成情况 第一种情况，欲分离制备的组分是一个主要组分，如图7-9的（a）。 ①通过改变容量因子K′，相对保留值α和增大塔板数n 来提高分离度Rs（图7-10中a、b）。 ②增大进样量直到柱子的负荷极限，但要保证使待分离组分与其他K′接近的组分有良好的分离。此时可以收集待分离的组分。 ③进一步增大进样量，柱子在过载的情况下运行，甚至会发生峰的重叠。此时应按中心切割法收集洗脱液（见图7-10中的d）。 图7-10 获得主组分最大制备量的途径 葡聚糖的特性与类型：亲水性较强，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的胶体。其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖孔径大小可以其吸水量的大小来表示，常以G-10至G-200号码标记。G后面的数字是其吸水量（mL·g-1干胶）乘以10所得的值。如G-25即表示吸水量为2.5。市售有G-10、G-12、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、G-200等型号。G-75以上的凝胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G-75以下的称为硬胶。 表6 交联葡聚糖的性质 凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖基本上不带电荷、呈惰性，不与被分离的物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量的活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐作洗脱液。 （2）其它 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel）、琼脂糖凝胶（Sepharose）等，适合于分离分子较大和不溶于水的化合物。 2.疏水性凝胶 在交联葡聚糖凝胶分子上引入一个基团，增大其亲脂性，便得到疏水性凝胶。例如，在Sephadex G-25分子上引入羟丙基（ROH → ROCH2CH2CH2OH），得到疏水性凝胶：葡聚糖凝胶LH-20，既有亲脂性又有亲水性，可用于分离酯类化合物、类固醇等。 三、操作方法 1.凝胶的选择 一般根据凝胶的分离范围进行选择。如果分离相对分子质量相差悬殊的组分：例如脱去蛋白质溶液中的盐类，可选择型号较小的凝胶（G-10，G-15，G-25），颗粒为100~150目。 分离相对分子质量比较接近的组分，凝胶颗粒要细（200目）且大小要近乎均一。 2.装柱 凝胶→用水或缓冲液浸泡使其充胀→用流动相浸泡→装柱 （1）凝胶溶胀（水化） 商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接使用，玻璃珠无需溶胀。 凝胶溶胀有两种方法： 室温溶胀 沸水溶胀 注1：各种葡聚糖凝胶在两种溶胀方法中所需的时间不同。必须浸泡足够的时间以便凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排除气体。 注2：凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉淀缓慢的细小颗粒随水倾去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速，洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。 柱子大小和凝胶用量的确定： 称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5mL的量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水到所需的柱床高度，将水倒出，量取体积。根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推算出干胶的需要量。 （2）装柱子 装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在铁架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝胶完全沉降。凝胶柱一般离柱顶3—5cm，以