一种牡丹内生抑制金黄色葡萄球菌的枯草芽孢杆菌、其分离方法及应用.doc

说 明 书 摘 要 本发明公开了一种牡丹内生菌、其分离方法及应用，所述牡丹内生细菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Mdgb45，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号是GDMCC NO ：60009。本发明的牡丹内生细菌菌株对金黄色葡萄球菌具良好的抑菌效果，可用于防治金黄色葡萄球菌。而牡丹内生细菌菌株发酵产物中的蛋白粗提物可作为抑制金黄色葡萄球菌的活性物质，该活性物质经过植物体内的筛选，对人畜无毒、无伤害，可直接开发为新型抗菌药物。 摘 要 附 图 权 利 要 求 书 1. 一种牡丹内生细菌，其特征在于：所述牡丹内生细菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Mdgb45，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号是GDMCC NO ：60009。 2. 一种分离纯化牡丹内生细菌的方法，其特征在于包括： 步骤1：从生长状态良好的牡丹根上剥取根皮，之后将根皮漂洗、冲洗、消毒、再冲洗后晾干作为样品，备用； 步骤2：将最后一次冲洗用的液体涂布于平板中作为对照组，并在温度为28℃下恒温培养； 步骤3：将样品放入无菌研钵中研磨至均匀，静置后取上清液并按1:9的比例稀释为2个梯度，之后把两个梯度的溶液涂布于固体平板上，并在温度为28℃的条件下培养，把每一个梯度再做3个重复，然后将对照组和样品组的两个梯度分别在平板上培养，用平板划线法对不同的菌落进行分离、纯化，即获得分离纯化后的牡丹内生细菌。 3. 根据权利要求2所述分离纯化牡丹内生细菌的方法，其特征在于：步骤1中漂洗根皮所用乙醇的质量百分比浓度为75%。 4. 根据权利要求2所述分离纯化牡丹内生细菌的方法，其特征在于：步骤2中消毒根皮的具体方法是将根皮置于质量百分比浓度3%的次氯酸钠中浸泡3min。 5. 一种利用牡丹内生细菌提取发酵液的方法，其特征在于包括：将牡丹内生细菌放于温度为37℃的NA培养基中过夜振荡培养，之后转移到PDA培养基中振荡培养48h，然后收集培养液，并在温度为4℃、转速为10000g的情况下离心2min，收集上清液并用0.22μ m的无菌滤膜过滤除菌即得所述的发酵液。 6. 如权利要求1所述的牡丹内生细菌于防治金黄色葡萄球菌病原菌中的应用。 7. 一种防治金黄色葡萄球菌病原菌的，其特征在于包括权利要求1-6中任一项所述的。说 明 书 技术领域 发明创造明属于生物技术领域，特别涉及一种牡丹内生菌、其分离方法及应用。 背景技术 植物内生菌是指生活在植物组织内，但不破坏宿主细胞而引起植物病害的一类微生物，它包括细菌、放线菌和真菌。植物内生菌可以从植物组织内部分离出来。目前药用植物内生菌能够产生多种抑菌、抗氧化的生物学活性物质，在生物制药，生物防治等领域具有非常广阔的应用前景，成为许多学者争相研究的热点。 [0003]牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）是我国特有的传统花卉，具有极高的观赏价值和药用价值，其药用栽培品种以‘凤丹’（Paeonia ostii‘Feng Dan’）为主，其根入药，名为“丹皮”，丹皮中含有牡丹酚、芍药甙、苯甲酸、挥发油及植物甾醇等多种药用活性物质，在抗菌、消炎、治疗心血管疾病、保肝、降血糖、降血脂、抗肿瘤等方面具有较好疗效。目前国内仅有一些关于牡丹内生真菌及次生代谢产物的研究。 [0004]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种较为常见的，易引起食物中毒的食源性致病菌，常会导致产品腐败和疾病传染，对食品安全构成巨大的威胁。随着抗生素和防腐剂的大量使用，耐药性菌株大量产生，开发新的抑菌活性物质迫在眉睫。 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在自然界广泛存在，对营养的要求不高且具有高度的耐盐性，它是人类化脓感染中最常见的病原菌，由于抗生素的广泛使用，已使90%多的金葡菌产生了耐药性，而且随着食品工业的快速增长，人们对食品防腐剂的安全性以及食品的保质期问题提出了更高的要求。一些食品腐败菌如金黄色葡萄球菌( Staphyloccocus aureus) 、大肠杆菌( Escherichia coli)等严重危害着食品安全，如何防止食品腐败变质及开发安全的食品防腐剂越来越受到重视目前，筛选金葡菌拮抗菌株的来源主要有土壤和海洋两个途径，而牡丹内生菌的研究也仅在内生真菌及次生代谢产物的研究方面。将两者结合起来关于药用牡丹内生细菌拮抗金葡的研究几乎没有，本专利以药用植物牡丹根部内生细菌为材料，从中筛选能够抑制金黄色葡萄球菌生长的内生细菌菌株，并探讨其活性代谢产物的抑菌活性，从而开发出抑制金黄色葡萄球菌的新的活性物质，避免耐药性菌株的产生。 发明内容 本发明的主要目的在于提供一种牡丹内生菌、其分离方法及应用