实验方法-1-核酸基因克隆资料.doc

目录 一、植物组织DNA提取步骤 王 芳1 二、核酸胶回收方法 杨玉萍1 三、酶切实验流程 曹文瀚1 四、DNA定点诱变载体构建方法 陈雪娜4 五、拟南芥cDNA质粒文库的构建 李丽娟6 六、植物细胞RT-PCR 杨玉萍12 ·RNA提取及纯化（材料不同，方法稍有不同） 13 ·普通PCR 15 ·半定量PCR 17 七、实时荧光定量PCR 李云爽17 ·引物设计 17 ·上样 18 ·Real time PCR仪器使用： 19 ·结果分析 25 ·作图 30 八、ABRC CD4-10/22 梁明炜34  一、植物组织DNA提取步骤 水稻全基因组提取步骤（参考CTAB法）收集水稻新鲜叶片，在液氮中速冻；液氮环境下，在研钵中迅速研磨，转入1.5 mL小指管；加入0.8 mL CTAB充分混匀；65 oC水浴30 min；加入等体积氯仿，充分混匀；离心4 oC，13,000 rpm，10 min；移上清至新的小指管，加入0.7倍体积的异丙醇，翻转混匀，静置5 min；离心4 oC，14,000 rpm，30 min；弃上清，用70 %的乙醇清洗两次，风干；加入ddH2O若干（30 μL)溶解，测定浓度后于-20 oC保存。 二、核酸胶回收方法 胶回收步骤 （一般都严格按照我们实验室购买的胶回收试剂盒说明书的步骤做即可，上面的注意事项也写的很清楚。） 测定质粒DNA浓度——NANODROP仪器测定： 用ddH2O将质粒DNA稀释一定倍数（如10倍）或不用稀释，备用待测。用ddH2O两次调零，然后加2 μl质粒，直接读取浓度。 三、酶切实验流程 贮存条件 大多数限制性内切酶保存在-20℃。只有少数内切酶(若储存时间超过30天)建议保存在-70℃。详细储存信息参考NEB内切酶使用说明书。反应缓冲液和BSA也应保存在-20℃。 每管试剂的管壁标签都会标有使用期限，注意及时更新过期的试剂。 确定酶切位点 通过质粒图谱软件（如Vector NTI 12.0）确定需要酶切片段的酶切位点，也可以通过NEB的网站在线查询，如下： /tools-and-resources/interactive-tools/enzyme-finder。 NEB限制性内切酶酶切体系的设置 50 μl单酶切体系 成分 体积 内切酶 1μl 质粒DNA 1 μg 10X NEBuffer 5 μl (1X) 100X BSA（依需要加） 0.5 μl(1X) 无菌水 补至50 μl 50 μl双酶切体系 成分 体积 内切酶 各1μl 质粒DNA 1 μg 10X NEBuffer 5 μl (1X) 100X BSA（依需要加） 0.5 μl(1X) 无菌水 补至50 μl 反应步骤：除内切酶，所有样品在EP管中混匀，低速离心后，加入相应体积的内切酶。根据内切酶的反应温度设定水浴锅或Heat-Block的温度（采用Heat-Block，EP管一定要用1.5 ml的规格，过小或过大的管体不易充分受热），反应过夜，但不能超过16 h。 注意事项 限制性内切酶室温下极易失活，所以只有在所有样品加完后，才能将内切酶从-20℃冰箱中取出，并一直置于冰上。取完内切酶后需要立即放回原处。 NEB公司每种限制性内切酶均配有相应的10X NEBuffer，在加样之前，需要根据自己所需要的内切酶选择合适的buffer。如果是双酶切的话，选择两种酶活力最高的buffer即可。 参考NEB产品目录上的内切酶的要求，加入终浓度为100 μg/ml的BSA(1：100稀释)。在不需要BSA的酶切体系中加入BSA不会影响酶切效果。 质粒DNA要避免酚、氯仿、酒精、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染。 通常情况下，采用5-10单位酶量/μg DNA，基因组DNA采用10-20单位酶量消化1小时。每μg 底物DNA建议在50 μl反应体系中消化。 FastDigest 快速内切酶酶切体系的设置 成分 体积 质粒DNA PCR产物 基因组DNA 10×FastDigest Green Buffer/ 10×FastDigest Buffer 2 μl 2 μl μl DNA 1 μg 0.2 μg 5 μg FastDigest 内切酶 1 μl 1 μl 5 μl 无菌水 补至20 μl 补至30 μl 补至50 μl /restriction-and-modifying-enzymes/restriction-enzymes/reaction-conditions-for-fastdigest-enzymes-chart/ 注意事项： FastDigest快速内切酶采用两种通用的反应缓冲液，即10×FastDigest Buffer 和10×FastD