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(2) siRNA转染的方法 到目前为止，转染的方法主要采用化学方法，化学方法不能转染的采用电转化等物理方法。 (3) siRNA转染试剂的主要种类 脂质体类 非脂质体聚合物类 (4) 脂质体 开发较早，主要针对转染质粒DNA等大分子开发，现在也被改良用于siRNA的转染； 适合siRNA与质粒的共转以及一些对毒性要求不高的siRNA转染； 代表产品有invitrogen公司的lipofectamineTM 2000和RNAiMAX。 (5) 非脂质体聚合物类 为克服脂质体转染试剂的毒性，并提高转染效率而开发，现在已从高分子聚合物类发展到纳米聚合物，这两年默克（Merck）、Qiagen和Clontech均相继推出了纳米聚合物类的转染试剂。 英格恩生物(Engreen Biosystem)也推出了纳米聚合物转染试剂EntransterTM系列，其中EntransterTM-R专用于siRNA转染。 第三部分siRNA转染过程相关问题及解答 1.siRNA转染过程相关问题 2.siRNA转染疑问解答 1.siRNA转染过程相关问题 (1) 转染细胞数量的问题 (2) 转染时siRNA工作浓度 (3) 转染时血清的问题 (4) 转染时抗生素的问题 (5) 转染过程 (6) 转染后换液的问题 (7) 转染条件优化的问题 (8) RNAi效应检测方法 (1) 转染细胞数量的问题 细胞数量：以转染时，细胞的汇合度在20％-40％为宜，这个汇合度比通常DNA转染的汇合度要小，这是因为转染后需要培养的时间通常比DNA转染的时间要长，同时较低的细胞数量也有利于提高抑制效率。 需要注意的是：转染时细胞的汇合度（细胞数量）会对RNAi结果产生一定的影响。一些转染试剂，如脂质体，需要的汇合度会高一些，这是为了减轻转染试剂的毒性，一般来说，细胞数量较少更能提高抑制效率。 (2) 转染时siRNA工作浓度 siRNA浓度：需要根据具体的实验进行相关的优化。过低的siRNA浓度达不到相应的抑制效果，过高的siRNA浓度可能会引起一些非特异的改变。需要注意的是这里siRNA浓度指siRNA在反应时的终浓度，也就是以转染时细胞的总体积来计算的。一般siRNA的有效反应浓度在10nM-200nM。 需要注意的是：siRNA的分子量，对21nt双链siRNA oligo来说，平均分子量约为13300g/mol，合成siRNA其OD值和nmol换算关系由于OD值受产物中其他成分影响，如荧光标记、纯度等，具体请询问合成公司，一般1OD duplex≈2.5-5 nmols≈33-66 ug。 (3) 转染时血清的问题 一些转染试剂要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h再更换成有血清培养基，这其实是为了减轻转染造成的细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R采用有血清转染，不用在有血清和无血清之间更换，增加工作量，同时有血清转染不仅不造成细胞毒性，甚至还有助于提高转染效率。 (4) 转染时抗生素的问题 一些转染试剂，如脂质体，需要在转染时采用无抗生素培养基，这是由于脂质体转染会同时将培养基的一些成份包括抗生素也带进细胞，造成细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R，由于不会将抗生素带进细胞，所以可以采用有抗生素转染，避免细胞污染。 (5) 转染过程 转染过程：转染的过程其实很简单。一般是分别稀释转染试剂和siRNA，然后二者混合，滴加到细胞表面，然后细胞继续培养。这点根据不同转染试剂的Protocol操作即可。 (6) 转染后换液的问题 一些转染试剂要求在转染后4-6h换液，其目的就是去除在培养基中的游离转染试剂，减轻细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R，大多数情况下无需转染后4-6h换液，只需第二天正常换液即可，减少了工作量，尤其大大减轻下午转染，夜里还需要换液的工作量。 (7) 转染条件优化的问题 优化转染条件不仅是为得到最高的基因抑制效率，更重要的是降低转染各条件对细胞的毒性。 优化的方面主要有：转染试剂的用量、siRNA的用量、转染时细胞密度、转染的过程（培养基、抗生素对细胞的影响），转染后细胞多长时间换液等。 (8) RNAi效应检测方法 mRNA水平：最简单和灵敏的检测方法是用qRT-PCR，一般在转染后24h-48h检测。 蛋白水平：常见的是Western Blot、免疫荧光检测和流式细胞检测。可在48h-72h检测。 生物学效应：细胞学、酶活性、芯片分析等。 2.siRNA转染疑问解答 Q：siRNA转染和质粒DNA转染有什么不一样？ A：1.siRNA转染多是蛋白表达抑制性实验，DNA转染多是蛋白过量表达实验，抑制性实验需要控制其他抑制性因素，如细胞毒性等