急性肝损伤模型建立.pptVIP

大鼠急性肝损伤的动物模型 前景 目前,肝损伤动物模型的复制主要有生物性、免疫性、化学性等方法,生物学方法要求实验条件高且费用昂贵,限制了应用。 免疫方法是造成免疫肝损伤,主要用于通过免疫机制而抗肝损伤的药物研究。如：卡介苗(BCG) 加脂多糖(LPS) 诱导法 、刀豆蛋白A 诱导法。 化学方法则是通过化学性肝毒物质,如四氯化碳、氨基半乳糖、硫代乙酰胺、黄曲霉素等致肝损伤。 这里我们以四氯化碳性肝损伤模型的建立来浅谈一下。 实验目的 1.掌握四氯化碳对肝脏的毒性机理，成功建立其急性肝损伤模型。 2.熟悉建模过程中的各个环节，并能解决相关问题，真正感受造模的过程，为将来真正进入实验做铺垫。 四氯化碳性肝损伤的机制 关于CCl4 肝毒的作用机制,存在多种假设,但都一致公认,其主要机制是自由基的形成及引发的链式过氧化反应。CCl4在体内可经肝微粒体细胞色素P450 代谢激活,生成两个活性自由基(CCl3O2 和Cl) 及一系列氧活性物,可与肝细胞质膜或亚细胞结构的膜脂质发生过氧化反应,膜磷脂大量降解,从而破坏细胞膜结构完整性,引起膜通透性增加,最终导致肝细胞死亡。另外,CCl4 的代谢产物能迅速与细胞成分如胞内脂质、蛋白、核脂质、核蛋白和DNA 等多种大分子发生不可逆的共价结合而导致细胞死亡,特别是当自由基作用于DNA 时,损伤核糖和碱基,使核酸直接破坏引起DNA 链的断裂或DNA 链与蛋白间交联,影响其信息传递功能以及转录和复制特性。在CCl4代谢产物引起的脂质过氧化物和共价结合的双重作用下,导致膜脂质流动性降低、钙泵抑制、谷胱甘肽活性抑制、肝微粒和线粒体功能丧失、肝细胞内钙稳态失调及代谢紊乱,引起肝细胞损伤加剧 。 四氯化碳性肝损伤的机制 引起氧化应激 氧化应激在CCl4 引发肝损伤的早期发挥着重要作用。 (1)引起自由基变化; (2) 引发与COX介导的炎症反应相关; (3) 导致肝星形细胞活化。 2 　引起体内相关酶系变化 (1) 转氨酶上升。CCl4 引发肝实质损害时,天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶活力升高,且酶活力的高低与肝细胞受损的程度相一致。 (2) 酶性抗氧化物改变。它们具有强烈的清除自由基的作用,且互相依赖和支持,形成网络式的抗氧化酶系统来拮抗CCl4 对肝脏造成的损伤。 (3) 细胞色素P450 酶系改变。CYP450 酶在CCl4 肝损伤发生过程中起到了十分重要的作用,以CYP2E1 最为受到关注。 3 　改变细胞因子活性　CCl4 引发机体产生的脂质过氧化产物,如丙二醛和42羟基壬醛,可引发转化生长因子2β1、TNF2α,白细胞介素等细胞因子的高表达,后者在CCl4 诱导的肝纤维化的过程中发挥着重要作用。 4 　引起细胞凋亡 CCl4引发机体产生的自由基的代谢紊乱会引起脂质过氧化产物的积累,进而促进肝细胞的直接死亡或者凋亡。其中,羟基自由基是促使肝细胞凋亡的重要体内物质。CCl4 引发肝细胞凋亡的机制复杂,一般认为都是通过激活死亡受体实现的。另外,CCl4 也可引起肝星形细胞的凋亡。CCl4 可激活核因子2κB ,引起细胞凋亡。 5 　毒性基因组学变化 近年来,国内外很多学者运用基因芯片技术对CCl4 的毒性机制进行了探讨,初步形成了CCl4 的基因组学研究体系。CCl4急性肝损伤实验表明,6 和24 h 是CCl4 的损伤阶段,而48 h 至2 周则是CCl4 后引发损伤后的自我修复阶段；CCl4 慢性肝损伤试验表明,30～60 d阶段作为脂肪变性期,60～90 d 为肝纤维化形成期。 建立模型方法 急性肝功能衰竭模型： a. 腹腔注射法：采用Wistar 或SD大鼠，重200±10g，约20只大鼠。实验组：用四氯化碳(CCl4 ) 溶于精致植物油, 配成浓度为10%、20%或更高40%的四氯化碳 ，予3-10ml/kg分组腹腔注射给药，12～24h（更早或更晚）后处死动物。取材，检测指标。 对照组：予相同剂量的精致植物油腹腔注射，余同上。 b.皮下注射法：颈背部或后肢外侧皮下注射，拔针是要注意药液外漏。 c.灌胃染毒法：试验前对动物隔夜禁食。 成模的标准 （1）血液：测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT) 、天门冬氨酸氨基转移酶(AST) 、总胆红质(TB) 、总蛋白(TP) 、白蛋白(A)血清等。 a.肝组织样品处理　血清:以3500 转/ 分离心15～20min ,取上清夜低温保存,于一周内检测完. b. 肝样:取011g 加1mL 生理盐水匀浆,以3500 转/ 分离心15～20min ,取上清夜低温保存,于一周内检测完. （2）组织病理学检查