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第一章 微生物培养技术 微生物: 微生物的分离和纯培养技术是微生物最基本的实验技术，它包括培养基的制备、灭菌和消毒、接种、培养等步骤 内容提要： 微生物及其分类 培养基与各类营养物质 无菌技术 菌落 大肠杆菌的纯化培养 微生物数量的测定 二、培养基 鉴别培养基: 加入伊红美蓝琼脂培养基（EMS培养基） 鉴别大肠杆菌 现象：蓝紫色金属光泽 Pour plate （一）直接计数法 ——显微镜直接计数法 计数室边长为1mm，则计数区的面积为l×1＝1 mm2，盖上盖玻片后计数室高度为0.1mm，所以一个计数室的体积为l×0.1＝0.1mm3。 (注意：1 ml ＝ 1000 mm3 ) 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。 2、接种 ⑴平板划线法 交叉划线法 连续划线法 1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_______ 2、在_______旁冷却接种环，并打开棉塞 3、将试管口通过火焰 4、将已______的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液 6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划__________条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。 5、将试管通过火焰，并塞上棉塞 火焰 冷却 三至五 7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_______开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。 末端 烧红 8、将平板_____放入培养箱中培养。 倒置 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。 杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。 及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 6支试管，分别加入9ml无菌水 1ml 101 1ml 102 1ml 103 1ml 104 1ml 105 1ml 106 ⑵稀释涂布平板法 a.梯度稀释菌液： 菌液 b.涂布平板： 滴 灼 试 涂 取0.1ml菌悬液 微量 移液器 (3)稀释混合平板法（课本P14) 将接种后的培养基和一个未接种的培养基，放入37℃恒温箱中倒置培养12h-24h,直到长出菌落为止。 3、培养 4、实验结果观察 5、菌株的保存方法 （1）临时保藏： 接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。 （2）长期保存： 甘油冷冻管藏法 搁置斜面 六、微生物数量的计算 直接计数法 间接计数法 将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出体积内的微生物总数。一般适用于纯培养液悬浮液中单细胞菌体的计数。 优点：直观、快速、操作简单 缺点： 不能区分死菌与活菌，所得为总数，结果往往偏高 不适于对运动细菌的计数 需要相对高的细菌浓度 个体小的细菌在显微镜下难以观察 1、血球计数板 计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个槽构成三个平台，中央平台又由一短槽隔成两半，其上各刻有一小方格网。 每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数室。 * * * * # # # # # 血球计数板计数室有两种刻度 1大格=16中格25×16=400小格 1大格=25中格 16 ×25 =400小格 计数室容积 * * * * 结构都相当简单，个体多数十分微小，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。 2、类群 1、特点 病毒（无细胞结构、寄生生活） 细菌 电子显微镜下的结核杆菌 放线菌 真菌 青霉菌 酵母菌 原生生物 病 毒 细 菌 放线菌 真 菌 原生动物 2、类群 无细胞结构 原核细胞 真核细胞 1、概念 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 按成分不同划分 天然培养基 合成培养基 化学成分不恒定的天然有机物 牛肉