基因的克隆与转化讲述.pptVIP

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实验四 基因的克隆与重组质粒的转化 实验目的 掌握外源基因与载体连接的原理及方式 理解重组体转化大肠杆菌的条件 了解转化的过程 实验步骤及原理 纯化载体 特定基因与载体连接 重组载体转化大肠杆菌 筛选含重组子的大肠杆菌 载体 外源DAN片段不能在细菌中稳定遗传,随细菌的繁殖而扩增。须有载体携带进入宿主细胞 专为分子克隆提供的载体特点: 多为环形 含多克隆位点,可选择适当内切酶切开 含抗药基因,可使宿主在含某种抗菌素的培养基上存活 可在宿主细胞中自我复制,也可随宿主细胞的繁殖而扩增 外源基因与载体连接 外源DNA片段与载体的连接有多种方式,选择不同酶切,连接方式也不同。 单酶切产生平端切口,与外源DNA片段连接,效率很低。因Taq酶的特殊活性,PCR产物3‘-末端常有突出的A。针对此特点,有3‘-末端突出的T载体。 单酶切产生粘末端,连接效率较高,但因载体两端的粘末端相同,故外源DNA片段的连接没有方向性,载体本身也容易回连。 双酶切产生粘性末端,连接效率高,且可确定插入片段的方向。 单酶切产生平端切口 单酶切产生粘末端 双酶切产生粘性末端 重组载体转化大肠杆菌 转化的关键是制备感受态细菌,使受体菌处于易于吸收和容纳外源DNA的易感状态。常用方法是氯化钙冰浴法。 0oC条件下用低渗CaCl2 溶液处理快速生长的细菌,使细胞壁疏松,细菌膨胀成球形。 重组DNA分子易吸附于感受态细胞表面,短暂的42oC热处理促进细胞对质粒的吸收。 制备感受态细菌 重组DNA分子进入细胞 筛选含重组子的大肠杆菌 转化细菌的培养 由于质粒携带抗药基因,故获得质粒的细菌可在抗性培养基上生长,形成单菌落。 重组子单菌落的筛选 获得质粒的细菌均可形成单菌落,故需进一步鉴定具有外源基因插入的重组子单菌落,常用方法是蓝白筛选(筛选原理下一实验详细介绍)。 操作步骤 载体及目的基因的酶切 酶切产物的纯化 载体与目的基因的连接 感受态细胞制备与转化 载体及目的基因的酶切 酶切产物的纯化 混合两组酶切产物,酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,方法见实验三。 载体与目的基因的连接 纯化产物溶于8 μl水中,再加入: 10×T4 DNA连接酶缓冲液 1 μl T4 DNA连接酶 1 μl 总体积 10 μl 16oC保温4小时或过夜,-20oC冷冻保存 感受态细胞制备(一) 受体菌的活化 取冻存XL1-blue菌株,划线接种于LB(amp-)固体培养基上,37oC培养过夜。 培养单菌落 用接种棒挑选单菌落接种于50ml LB(amp-)液体培养基,37oC振荡培养6-8小时 制备感受态菌的最佳时机一般以菌液出现轻度混浊为宜。 感受态细胞制备(二) 3000rpm离心5min,弃上清。 25ml预冷的0.1M CaCl2悬浮菌体沉淀,置冰浴中静置30min。 3000rpm离心5min,弃上清。 1ml预冷的0.1M CaCl2悬浮菌体沉淀,置冰浴中过夜。 转化(一) 取1.5ml离心管3支,按下表操作: 转化(二) 取4皿amp+固体培养基,每皿加入IPTG8μl,X-gal 40μl,均匀涂布,置37oC恒温箱至液体消失。 阳性对照与阳性对照各取50μl涂布于抗性平板。实验组以50μl、100μl分别涂布于抗性平板。 37oC恒温箱培养过夜。 待有肉眼可见的菌落出现,将实验组培养皿移至4oC显色,待用。 * * CaCl2 0oC 分别混匀,置37oC保温1.5小时 80 μl 20 μl 总体积 12 μl ddH2O 4 μl EcoRⅠ 1 μl EcoRⅠ 4 μl BamHⅠ 1 μl BamHⅠ 8 μl 10×Buffer 2 μl 10×Buffer 64 μl PCR纯化产物+ ddH2O至 4 μl 质粒(Bluescript) 目的基因的酶切: 载体的酶切: 1μl pBluescript 5μl 连接反应液 100μl 100μl 100μl 感受态菌液 阴性对照组 阳性对照组 实验组 42oC准确水浴90秒,迅速取出,置冰水浴。 各管加入amp+ LB培养液200 μl,混匀,37振荡复苏45min。

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