酶工程4-4离心分离预案.pptVIP

第四节 离心分离 （一）基本原理 1. 离心力 Fc = m ac ＝ m r ω2 ＝ m r （2? n/60）2 n为离心机每分钟转数 （r/min ）； Fc通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（Fg , 重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字?g）表示。; RCF= Fc / Fg = m r (2? n/60)2 /mg= 1.12 ?10-5 n2 r 即： 离心力的大小与转速的平方( n2 ) 以及旋转半径(r) 成正比。 其中，旋转半径用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm ; 通常： 低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。 高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表 示，如：65000g。 两者可换算或查测算图。;计算近似RCF的列线图;2. 沉降系数:（sedimentation constant） 指单位离心力下颗粒的沉降速度（sedimentation velocity）,用S表示。 由于许多生物大分子的S值很小，所以定义10 ?13 s 为一个沉降单位，1S = 1?10?13 s。 常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如16S RNA，蛋白质的沉降系数一般在1 ~ 200之间。 ;（二）离心条件;沉降时间; 2. 温度 离心温度一般控制在4℃左右, 对于某些耐热性较好的酶, 也可以在室温条件下进行离心分离。但是在超速离心和高速离心时, 由于转子高速旋转会发热而引起温度升高, 必须采用冷冻系统, 使温度维持在一定范围内。 3. pH值 离心介质的pH 值必须是处于酶稳定的pH 值范围内, 必要时可以采用缓冲溶液。过高或过低的p H 值可能引起酶的变性失活, 还可能引起转子和离心机其他部件腐蚀。;（三）离心机的种类 按离心机转速的不同，分为： 常速（低速）离心 高速离心 超速离心;名称 ;离心的形式;角式离心机和离心头（转子）;离心管;离心机操作;;;（四）常用离心方法 差速离心法 沉降速度法 密度梯度离心 沉降平衡法 等密度梯度离心;1．差速离心 （differential centrifugation） 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。 特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 优点：操作简单 。 缺点：1）分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。 2）壁效应严重。 3）沉降的颗粒受到挤压。; 差速离心分离示意图 （a）离心前的悬浮液 （b）～（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况 ;2．密度梯度离心 （density gradient centrifugation） 样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。 常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。 ;梯度介质;密度梯度混合器;图4-1 3 种梯度形式示意图 (a) 线性梯度; (b) 凸形梯度; (c) 凹形梯度。;图4-2 梯度混合器示意图 A-混合室; B- 贮液室; C-电磁搅拌器; ○-阀门。;离心操作;密度梯度离心特点： 区带内的液相介质密度小于样品物质 颗粒的密度。 适宜分离密度相近而大小不同的固相 物质。; 密度梯度离心示意图 （a）离心前 （b）离心后 ;Density gradient ultracentrifugation;3. 等密度梯度离心 又称沉降平衡离心 （sedimentation equilibrium centrifugation）。 根据颗粒的密度不同而进行分离。 离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置(等密度点)，形成区带。 ;离心???质 常用铯盐, 如氯化铯( CsCl)、溴化铯( CsBr) 、硫酸铯 ( Cs2 S O4) 等。有时也用三碘苯的衍生物作为离心介质。 特点 介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密