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酶组织化学各论;一、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶在碱性环境下能催化各种醇和酚的磷酸酯水解。其反应通式如下:; 1.钙-钴法光镜显示方法 (1)钙-钴法的原理 碱性磷酸酶将磷酸盐的底物分解产生磷酸离子为孵育液中的氯化钙捕获生成磷酸钙沉淀,加入硝酸钴,使之转变为磷酸钴沉淀,再通过硫化铵处理,形成棕黑色硫化钴颗粒沉淀,以显示酶活性所在部位。; (2)孵育液的配制:3%β-甘油磷酸钠 10ml(底物)2%巴比妥钠 10ml(缓冲液)2%氯化钙 20ml(捕获剂)5%硫酸镁 5ml(激活剂)D.W 5ml孵育液最终pH值9.4,置于冰箱保存。 ; (3)操作步骤:①新鲜组织,作冰冻切片(可用10%福尔马林 固定10min,或不固定)②入孵育液,37℃孵育 30~60min (磷酸钙沉淀形成)③蒸馏水冲洗 5min④置2%硝酸钴内 2min(磷酸钴形成)⑤蒸馏水冲洗⑥置1%硫化铵溶液内 1min(硫化钴形成)⑦蒸馏水冲洗⑧甘油明胶封固 (非脂溶剂稳定沉淀); (4)结果与评价:碱性磷酸酶活性产物为棕黑色硫化钴沉淀。该法的反应产物可发生扩散,故定位欠准确。 (5)对照:从孵育液中去除底物或用左旋咪唑等抑制剂的方法。 ;; 2.偶氮-偶联法光镜显示方法 (1)偶氮色素法的原理 偶氮色素法是捕捉与磷酸同时释放出的醇或酚,以偶氮色素的形式产生沉淀的方法。如底物使用β-磷酸萘酯,通过酶的作用,水解生成的β-萘酚,后者为重氮盐捕捉,生成红色的偶氮色素沉淀。;; (2)孵育液的配制:萘酚AS(或萘酚AS-MX)10~25mg(底物)N,N-二甲基甲酰胺液 0.5ml(促溶剂)0.2mol/L Tris-盐酸(pH9.2) 50ml(缓冲液)坚牢蓝B 50mg(捕获剂) 以上混合和过滤,必要时可用氢氧化钠调整pH9.0~9.2值。 ; (3)操作步骤:①新鲜组织,作冰冻切片;②入孵育液,37℃或室温 5~60min (有色沉淀形成)③双蒸馏水冲洗 3~5min④4%甲醛,室温下固定 10~50min⑤蒸馏水冲洗 3~5min⑥甘油明胶封固。 (脂溶性沉淀) ; (4)结果与评价:采用不同的重氮盐,酶的活性显色也不同 萘酚法有三个优点:①反应产物溶解度小,局部比较明显;②萘酚化合物能比较快地被水解,可缩短孵育的时间;③反应产物立即可见,并显示出颜色。; 3.柠檬酸铅电镜显示法 (1)预处理: ①固定:2%戊二醛(0.1mol/L二甲胂酸缓冲液,8%蔗糖,PH7.2~7.4),固定60min;或4%多聚甲醛固定数小时至12h。 ②切片:冰冻切片机或振动切片机切片40~50um。; (2)孵育液的配制:0.2mol/L Tris-HCl(pH8.5) 1.4ml(缓冲液)3%β-甘油磷酸钠 2.0ml(底物)0.015mol/L MgSO4液 2.6ml(激活剂)蔗糖 0.5g (和缓剂)0.5%柠檬酸铅 4.0ml(捕获剂) 共计 10ml(pH9.0~9.4); (3)方法与步骤:①新鲜组织,或甲醛固定并作冰冻切片40um;②入孵育液,37℃,孵育 15~30min;③蒸馏水洗;④冷1%锇酸(OsO4),30min;⑤蒸馏水洗;⑥梯级酒精脱水;⑦环氧树脂包埋,超薄切片,电子染色;⑧电子显微镜观察。; (4)结果与评价:磷酸铅呈现高电子密度颗粒,主要分布在细胞膜上。 (5)对照:孵育液中去除底物或加入抑制剂(如β苯丙氨酸或四唑或溴四唑),则酶活性为阴性。;二、酸性磷酸酶 酸性磷酸酶是一种在酸性环境下能水解磷酸单酯的酶。其反应通式与碱性磷酸酶相同。 酸性磷酸酶活性的检查法一般可分为金属盐法和偶氮色素法。; 1.金属盐光镜显示方法 (1)显示原理 显示酸性磷酸酶的铅法其基本机制类似于显示碱性磷酸酶的钙-钴法,但因磷酸钙在酸性溶液中是可溶性化合物,故改用硝酸铅作捕获剂,最后与硫化铵
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