分子生物学人类基因组DNA提取等资料.pptVIP

人类基因组DNA提取 限制性核酸内切酶切割的原理、方法 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用;人类基因组DNA提取; 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织 是最常用的材料。 原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似。 ; 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重 要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100- 200kb。 一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新 鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取， 常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下，用蛋白酶K 消化细胞，随后用酚抽提而实现的。 这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于 Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实 验。 ;一.材料 一份提取总DNA的细胞或组织 1.5ml、 微量离心管、微量移液器与吸头、15ml离心管、锥形瓶（500或1000ml）。 二.设备 离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸水浴、透射紫外灯。 ;三.试剂 1.细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA 2.0.8%（W/V）标准琼脂糖； 3.0.5×TBE缓冲液 4.其他试剂：TE缓冲液或重蒸馏水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲液、溴化乙锭（EB）;实验材料;1.EDTA：钙离子络合剂，在分子生物学实验中是二 价金属螯合剂，抑制核酸酶，降低细胞膜的稳定性； 2.SDS（十二烷基硫酸钠）：是一种去污剂，破坏细 胞膜的脂质膜； 3.蛋白酶K：一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋白 质（包括糖蛋白和肽类）及脂类和胺类物质，但糖 蛋白的降解物常与DNA一同沉淀下来，干扰酶的活 性，消化后需要用酚、氯仿抽提纯化； 4.酚：使蛋白质变性，将变性的蛋白质溶解在其中； 5.氯仿：一种有效的蛋白变性剂，能促进两相的分离。 ;DNA提取原则;四、操作步骤（酚法抽提染色体DNA）;3. 加等体积饱和酚，轻摇混匀10分钟，室温12000r/min离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。 4. 小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀5分钟，室温12000r/min离心5分钟。 5. 小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。;6. 将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2倍体积的无水乙醇，摇匀，静置10min，12000r/min离心10分钟，用新配制的70%乙醇洗两次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100ml TE缓冲液中，测OD（吸光度）值。 7. TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置于70℃保存。 ;电泳鉴定;基因组DNA提取的意义;限制性核酸内切酶;识别及切割位点 限制性核酸内切酶只能识别特殊的碱基序列，作 用于切断相邻碱基之间的磷酸二酯键； 通常切割4～6个碱基对、具有回文序列的DNA片段， 大多数酶是错位切割双链DNA，产生 5ˊ或3ˊ黏性末端。 如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端： ; ;琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶电泳的应用 （1）适合分离大片段DNA。 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的 DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围??0.2-20kb,利用脉冲电泳，可分离高达 bp的DNA片段;（2）可提取大分子DNA 利用琼脂糖凝胶制成凝胶块提取基因组DNA能够获得足够大的DNA片段，可以完全符合构建粘粒基因组文库的要求。