克隆表达-真核表达系统-2002.pptVIP

;克隆载体与表达载体;克隆载体中常用的辅助序列;返回;1、克隆载体，全长3.19kb，具有Amp抗性基因和复制起始点 2、MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子---可进行体外转录；为插入片段的测序提供特异引物位点 3、MCS为于lacZ’基因内部（插入失活）—蓝白斑筛选 4、引入丝状噬菌体f1(+) 复制起始点-----可以产生单链DNA，并分泌至上清中，;分泌型融合表达载体，有两个启动子（Plac,Pspa），启动子下游装有SPA的信号肽序列和两个结构基因ZZ。产生与SPA蛋白ZZ段融合的蛋白，并可将融合蛋白分泌出胞 4.59kb，含Amp抗性基因和原核复制起始点 有f1复制起始点，可产生单链DNA ;目的基因在原核细胞中表达的技术路线 目的基因 表达载体 ;五．提高表达水平的手段 1、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子----提高转录水平 核糖体结合位点（ATG---SD） 避免产物降解 ：分泌/融合表达 细菌蛋白酶抑制剂 ;2、选择合适宿主 Lac 启动子----LacI菌 PL/PR -------- CI857 溶源菌 ;3、诱导表达 温度诱导------PL/PR IPTG的化学诱导----Plac、Ptac 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解;六．表达产物的检测： 1、特异性鉴定：免疫学方法 荧光抗体法 免疫沉淀法 免疫印迹法 ELISA 2、生物学活性鉴定 ;真核基因表达系统;一、概述 （一）原核表达系统的缺点 1、没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子 2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工 ;（二）真核表达系统的必要性及优势 1. 具转录后加工系统 2. 具翻译后修饰系统 3. 可实现真正的分泌表达 4.基因治疗 ;二、真核基因结构及表达调控特点 （一）真核基因组的复杂性 真核基因组庞大，具大量非编码序列 ---mRNA丰度不同 结构复杂：染色质、核膜、线粒体---表达调控多样 不连续性：内含子、外显子 没有操纵子结构 ;（二）真核基因表达调控特点---多层次、多方面 1、转录前水平(基因组水平)：基因结构上的改变、稳定持久、不可逆 2、转录水平调控 3、转录后调控 4、翻译水平的调控 5、翻译后修饰 ;转录水平调控 顺式调控因子(cis-acting factor)：结构基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列，主要包括启动子、增强子、沉寂子 反式作用因子(trans-acting factor):由位于不同或相同染色体上相距较远的基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转录活性。 ;顺式调控因子1-----启动子： 核心启动子元件（转录起始点及-30区的TATA-box）：决定基因转录的精确起始 上游启动子元件(包括： -70~-80bp区域的CAAT盒及其两侧的GC盒):协同决定转录的基础效率 组织特异性元件 诱导性启动子元件 ;启动子结构模式图;顺式调控因子2-----增强子(enhancer) 是一种能够提高转录效率的顺式调控元件 增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动子没有严格的专一性 无方向性(序列、位置） 远距离作用 无基因特异性 具组织特异性;转录信号1;三、真核表达系统 组成：真核表达载体 受体细胞 基因转移方式 ;1、真核表达载体： 适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。 真核载体根据受体不同，又可分为几种 酵母表达载体 哺乳动物表达载体 昆虫杆状病毒表达载体 ;2、受体细胞 据受体细胞及表达载体的不同分为3种： 酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统 ;四、外源基因在酵母细胞中的表达 -----酵母表达系统 发酵简单、快速、便宜 真核生物，有翻译后修饰功能 受体细胞安全 可分泌表达，简化了纯化工艺 ;（一）酵母表达载体 1．筛选标记： 遗传标记：营养缺陷标记基因 抗生素选择标记基因 ;2、用于酵母载体中的调控序列： ARS：酵母复制起始区(点) 2μM质粒：酵母核质中的小的环状DNA，可以独立复制并转录。 酵母启动子：常用的有ADH1(醇脱氢酶)、SUC(蔗糖酶)、PGK(磷酸甘油激酶)、Apase(碱性磷酸酶)启动子。 酵母着丝粒区段(cEN)：增加转化子稳定性 ;3、类型 酵母克隆载体：YIP、YRP、YEP 酵母表达载体：含酵母启动子 YAC;酵母克隆载体的构建;酵母表达载体