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基因工程Gene Engineering ;第一节 工具酶 第二节 载体 第三节 分子克隆的基本步骤 第四节 基因工程的应用;限制性核酸酶内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 核酸酶S1 ;第一节 工具酶 一、限制性核酸内切酶 ;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;作用 Ⅰ Ⅱ Ⅲ;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;限制性核酸内切酶的主要用途 ;DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段 ;DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段 ;第一节 工具酶 二、DNA聚合酶 ;Klenow片段的主要功能有： 1)补齐双链DNA的3?末端，同时可使 3?末端DNA标记同位素； 2)在cDNA克隆中，合成cDNA第二链； 3)DNA序列分析。 ;一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65 kd， 最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有5?→3? 聚合酶 活性和依赖于聚合作用的5?→3?外切酶活性。 Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过 PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增。;依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板、 4种dNTP为底物，催化合成DNA， 其功能主要有： 1)逆转录作用； 2)核酸酶H的水解作用； 3)依赖DNA的DNA聚合酶作用。;5?;分子量为60 kd，在二价阳离子存在下， 催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链 DNA分子的3?末端-OH上。 ;(A、G、C、T)n;大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两种类型， 分子量分别为7 500和6 000，两者的辅基不同， 前者需NAD+，后者需ATP。 它们催化的反应也不尽相同，大肠杆菌DNA连接 酶只能连接粘性末端，而T4DNA连接酶既能连接 粘性末端，又能连接平末端。 ;第一节 工具酶 六、 DNA连接酶;催化去除DNA、RNA或dNTP上的5?-磷酸基团， 其主要用途有： 1)除去DNA片段上的5?磷酸，以防自身连接。 2)在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前， 除去RNA或DNA上5?端的磷酸。; ;功能：水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分。;第二节 载体; 常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。 载体大都经过改造，如质粒改造后携带某些选择性标记和克隆位点的遗传信息； ?噬菌体改造后只保留同一种限制酶的单个或两个切点。在常用的克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA序列）即为表达载体，它不仅可携带外源基因片段进入宿主细胞，而且可在宿主细胞中表达外源基因。; ①能自我复制并具较高的拷贝数。 分子量一般 10Kb。 ②带有遗传筛选标记。 ③有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。（multiple cloning sites，MCS） 。; 能将载体外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体。 （一）质粒载体 质粒（plasmid）是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。;① 用于保存和扩增 2Kb目的DNA。 ② 构建cDNA文库。 ③目的DNA的测序。 ④ 作为核酸杂交时的探针来源。; 复制起始点;pUC18、pUC19质粒载体; ?-半乳糖苷酶能催化指示剂底物5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷（X-gal ）形成蓝色菌落。pUC载体的lacZ?基因中含有MCS，当外源基因插入MCS，lac ?-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无?-半乳糖苷酶活性，菌落呈白色（即半乳糖苷酶的蓝白斑筛选实验）。 PUC质粒系列还包括pUC8、pUC9和pUC118、pUC119，它们的区别在于MCS的限制酶识别位点数目不同，而每一对pUC质粒的MCS中限制酶识别位点数目相同、顺序相反。 ;噬菌体（bacteriophage，phage）： 指感染细菌的病毒。按其生活周期分为两种类型： 溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。 溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中去，和细菌染色体一起复制。;?噬菌体 野生型的?噬菌体是线性双链DNA，全长48.5Kb，其中60%（约30Kb）是溶菌生长所必需，中间40%的区域为非必需，可被外源DNA片段代替而不影响?噬菌体的生存。?噬菌体5?末端含12核苷酸的互补单