07第七章__亲和层析概念.ppt

第七章 亲和层析 ;1967年Axen等 用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法，并成功地制备了固定化酶。 这种利用大分子物质具有的特异的生物学性质进行纯化的方法，于20世纪70年代就有了惊人的发展，并逐步得到了广泛的应用。 这使酶类等大分子物质的纯化过程变得较简单、迅速和高效(见表7-1)。;;第一节 基本原理 ;亲和层析法 根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析方法，称为亲和层析法(affinity chromatography)。;亲和层析的原理(见图7-1)：;层析分离过程： 样品过柱时， 样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上; 无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰； 然后，恰当地改变起始缓冲液的 pH值、 或增加离子强度、 或加入抑制剂等因子， 即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第二个层析峰(见图7-2B)。;;如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时， 则采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。 使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。;上面介绍的亲和层析法亦称： 特异性配体亲和层析法 配体,一般为 复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力； 另有一种亲和层析法叫： 通用性配体亲和层析法 配体,则一般为 简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)，它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。;特点： 亲和层析的分辨率比凝胶过滤层析高。 用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧失。 该法的缺点是： 要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固相载体之后方可进行。;第二节 操 作 ;4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合； 5．适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。 具体要求须根据分离物的性质而定： 当分离物与配体亲和力弱时，选用多孔性好的基质可提高结合容量； 当分离物呈颗粒状或碎片状时，则选用多孔性差的基质对改善分离效果有利。 一般亲和吸附剂采用的基质有：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻璃珠。 ;相比之下，实践中应用较多的基质是： 聚丙烯酰胺凝胶(Bio-300)、 多孔性玻璃珠、 琼脂糖珠(Sepharose 4B)。 三种基质中，目前应用最多的是： Sepharose 4B ;Sepharose 由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖； 它基本上能符合理想基质的五点要求； 同时Sepharose极易用溴化氰活化，并易于引入不同的基团； 在温和的条件下，可以连接较多的配体，容易吸附大分子物质，且吸附容量也较大； 此外，Sepharose 4B的结构比Sepharose 6B疏松，机械强度比Sepharose 2B好。 因此，Sepharose 4B成了亲和层析中广泛使用的一种基质。; 二、配体的选择 可选择的配体有： 抑制剂、 效应物、 酶的辅助因子、 类似底物、 抗体[包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)-蛋白质复合物抗体]、 其他物质(如外源凝集素、polyA、polyU、染料和金属离子)等。 ;优良的配体须具备两个条件： 1）与纯化的物质有较强亲和力 一般来说， 配体对大分子物质的亲和力越高(即Ki（抑制常数）或Ka（解离常数）较小)，在亲和层析中应用的价值就越大。 2）具有与基质共价结合的基团 该基团和基质结合后，对配体与互补蛋白的亲和力没有影响或影响不明显。 就目前所知，可用作配体的种类很多，表7-2。 ; 三、亲和吸附剂的制备 把配体偶联到基质上的方法有两类： 物理的（如包埋法和吸附法等） 化学的（如偶联法和交联法等） 交联法： 是用双功能试剂(如戊二醛、碳化二亚胺等)交联基质和配体。 偶联法： 常用的化学试剂有： 溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二烯砜和亚氨二乙酸等， 用其活化的基质与配体偶联，或者用其把基质与配体螯合起来 ;溴化氰偶联法 主要包括： 1.活化 2.偶联 3.除去未结合的配体 4.配体结合量的测