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医学病毒的培养与储存 关键词：病毒 细胞 细菌 化学试剂 标准物质中心 北京标准物质网 对于病毒学家来说，要想研究病毒，首先要学会培养病毒。人们已经发明了各种各样的方法培养病毒，有些方法是在无细胞系统下培养病毒，但是大部分情况下都是在病毒允许细胞中培养病毒。 用细菌来培养噬菌体，特定的植物或者去除细胞壁的植物细胞培养植物病毒，而培养动物病毒可以用生物体，例如鼠、含有鸡胚胎的鸡蛋或者昆虫幼虫。 根据接种的宿主不同，接种方法可以分为以下三种。 1.动物接种 是最原始的病毒培养方法。常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等，接种的途径有鼻内、皮下、静脉、脑内等。根据病毒种类不同，可以选择不同的敏感动物及适宜接种部位。 2.鸡胚培养 是最常用的方法之一，鸡胚组织分化程度低，细胞幼嫩，有利于病毒的生长。接种鸡胚对多种病毒敏感，根据病毒种类不同，可将标本接种于鸡胚的羊膜腔、卵黄囊、屎囊腔或者绒毛尿囊膜上。 3.组织培养 将离体活组织块或分散的活细胞加以培养。组织培养法有三种基本类型：器官培养、移植培养和细胞培养。细胞培养最常用于培养病毒，根据细胞的来源、染色体特性及传代次数可以分为下列四种类型：原代细胞培养、次代细胞培养、二倍体细胞系和传代细胞系。 大部分病毒很容易被冻存在细胞培养基中。病毒是一种无细胞结构的生命体，个体小、结构简单并且不含水，因此比其他微生物更稳定。病毒的感染力在低于-60会保存得很好，如果温度逐渐升高 超过 ，其感染力会显著下降。 一般而言，小病毒比大病毒稳定；DNA病毒比RNA病毒稳定；在室温条件下，无包膜病毒比有包膜病毒稳定，这种差别在低温或者极低温度下不明显。一般不推荐将病毒悬液储存在-20。但是如果对病毒感染力没有要求，储存的样品只用于临床诊断 例如利用ELISA检测病毒抗原 ，可以将样品储存在-20，在这个温度下病毒的抗原活性不变。 在液氮中储存的病毒库，如果没有保存在热收缩管中，可能会造成交叉污染。蛋白质对于病毒保存来说是一种有效的保护剂，一般来说，使用的悬浮培养基为包含10％或者更高含量血清或者其他蛋白的组织培养基。尽管蛋白保护的具体机制现在还不太清楚，但是在病毒冻存期间其对pH变化 病毒储存的最佳pH在7．0到8. 0之间 的缓冲能力都有利于病毒感染力的保存，并且能够帮助病毒颗粒储存在胶体分散体中，减少或者抑制有损核酸的反应。储存不稳定的病毒时，可以利用特殊的蛋白保护剂，包含1％的牛血清蛋白的蔗糖-磷酸-谷氨酸溶液或者高渗透性的蔗糖溶液，例如呼吸道合胞病毒。 一般来说，推荐使用高滴度的病毒悬液，并且小体积 0. 1～0．5ml 快速冷冻储存。在使用病毒之前，应将冻存的病毒小管迅速放到37水浴锅里解冻。包含病毒病原物的样本可以保存在-70或者-80几年时间，而病理学特性不会改变。在组织或者血液来源的样本中，病毒可以储存在极低温度下，而不用特殊处理。储存在加有10％FBS和10％DMSO的RPMI 1640的外周血淋巴细胞一般用来分离HIV。另外，一定要注意多次冻融血清样本对核酸稳定性的影响。