第三章基因工程的载体重点.pptVIP

第二章 基因工程的载体和工具酶;引 言;一、 质粒载体 （plasimid vectors）;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（二）质粒DNA的制备;碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。 在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。 通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。;碱变性法提取质粒的步骤： 1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀； 2、加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）涡旋震荡悬浮菌液。 3、加入200微升新配制的溶液II，（0.2M NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。 4、加入150毫升冰冷的溶液III，（醋酸钾29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸馏水至100毫升）颠倒离心管10次后，冰浴5分钟。 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。;（三