锌离子影响朊蛋白错误折叠机制教程方案教程方案.doc

分类号 密级 UDC 编号 武 汉 大 学 博 士 学 位 论 文 锌离子影响朊蛋白错误折叠 机制研究 ：潘锴 指导教师姓名、职称：梁毅 教授、博导 ：生物学 生物化学与分子生物学 ：结构生物学 二〇一五年九月 Classified number: Secret grade: UDC: Thesis number: Wuhan University Doctor of Philosophy Thesis Mechanisms for Zinc Modification on Prion Protein Misfolding Student name: Pan Kai Name and Title of Adviser: Prof. Liang Yi Faculty and Specialty: Biology, Biochemistry and Molecular biology Research Area: Structural biology September, 2015 郑重声明 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论文没有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为，否则，本人愿意承担由此而产生的法律责任和法律后果，特此郑重声明。 学位论文作者（签名）： 年月日  论文创新点 本文系统研究了锌离子影响朊蛋白聚集的分子机制，发现锌离子可以改变朊蛋白的聚集途径和聚集体的结构，野生型朊蛋白的聚集途径分为典型的个阶段加入(M锌离子后野生型朊蛋白。与野生型朊蛋白不同的是八肽重复序列缺失的朊蛋白在或锌离子的情况下都可以形成典型的纤维。锌离子改变朊蛋白聚集的途径和聚集体的结构主要朊蛋白八肽重复序列朊蛋白锌离子在中的作用，有助于解释锌离子修饰朊病毒株型的。 目录 中文摘要 I Abstract III 第一章 前言 1 1.1 朊病毒假说及其证实 1 1.2 Protein X 4 1.3 种间屏障和朊病毒株 5 1.4 细胞型朊蛋白概述 8 1.5 细胞型朊蛋白的生理功能 10 1.6 朊蛋白与锌离子 10 1.7 锌离子的生理功能和稳态 11 1.8 锌离子对细胞凋亡的影响 13 1.9 锌离子和神经细胞的死亡 14 1.10 离子和蛋白质聚集 16 1.11 Prion-like蛋白和神经退行性疾病 22 第二章 锌离子对人朊蛋白聚集途径和聚集体结构的影响 25 2.1 摘要 25 2.2 引言 25 2.3 实验材料和仪器 26 2.3.1 实验材料 26 2.3.2 主要仪器 26 2.4 实验方法 27 2.4.1 朊蛋白的原核表达与复性纯化 27 2.4.2 ThT荧光法检测纤维生长动力学 31 2.4.3 Sarcosyl-soluble SDS实验 31 2.4.4 透射电镜观察聚集样品 32 2.4.5 等温滴定量热法测定锌离子和朊蛋白及其突变体的结合 32 2.4.6 圆二色光谱法测定蛋白的二级结构 33 2.4.7 圆二色光谱法测定蛋白质的热稳定性 34 2.4.8 傅里叶红外光谱法分析聚集体的二级结构 34 2.5 实验结果 35 2.5.1 人野生型朊蛋白及其突变体的分离纯化 35 2.5.2 ThT荧光法监测锌离子对人野生型朊蛋白及其突变体的聚集动力学的影响 36 2.5.3 Sarkosyl-soluble SDS实验检测锌离子对人野生型朊蛋白及其突变体的聚集动力学的影响 39 2.5.4 透射电子显微镜观察锌离子对朊蛋白所形成聚集体形态的影响 41 2.5.5 高分辨率透射电子显微镜观察人野生型朊蛋白的聚集过程 42 2.5.6 等温滴定量热法研究锌离子和朊蛋白的结合 45 2.5.7 检测锌离子对朊蛋白及其突变体热稳定性的影响 49 2.5.8 检测锌离子对朊蛋白及其聚集体的二级结构的影响 51 2.5.9 蛋白酶K酶解实验检测朊蛋白聚集体的抗酶解能力 56 2.5.10 ThT-UV同步检测朊蛋白纤维生长动力学 59 2.6 讨论 62 第三章 锌离子对细胞水平朊蛋白聚集的影响 66 3.1 摘要 66 3.2 引言 66 3.3 实验材料和仪器 67 3.4 实验方法 67 3.4.1 相关缓冲液的配方 67 3.4.2 Western Blot对细胞内可溶于S