色谱分离技术课题.ppt

（四）操作方法 具有亲和力的一对分子中的一个作为配基，与不溶性载体结合，使之固化，装入色谱柱 含目的物的混合液作为流动相进入色谱柱，配基选择性吸附目的物质，杂质不能被吸附而直接流出。 改变条件使配基与其亲和物解离 亲和层析的基本过程： 具体操作： ① 样品制备 含杂质，需预处理： ② 配体与配基结合条件的选择 pH、缓冲液浓度、离子强度 ③ 柱操作 ④ 流速的控制 ⑤ 清洗 ⑥ 洗脱 ⑦ 柱的再生 蛋白沉淀、离子交换柱层析 柱的大小、长短 高速度、高效率 除去不结合的所有物质 特异性洗脱（竞争性置换目的物） 非特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度） （五）亲和色谱法的应用 1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速 2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离以下物质：杂质与目的物间的溶解度、分子大小、电荷分布等性质差异小，相对含量低，其他经典手段分离有困难的高分子物质；尤其是对分离某些不稳定的高分子物质更具有优越性。 如：酶、rRNA、抗原和抗体的分离，激素的提纯 ② 分离纯化各种功能细胞、细胞器、膜片段和病毒颗粒 ③ 用于各种生化成分的分析检测 ④ 与亲和色谱有关的特殊技术应用 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 亲和色谱法 高效液相色谱法 混合物随流动相通过固定相时，由于固定相对混合物中各组分的吸附能力不同对其分离 固定相和流动性都是液体，根据混合物中各组分在两相中的分配系数不同而分离。 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而进行分离 以凝胶为固定相，依靠各物质的分子大小和形状不同对混合物进行分离 利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性对其进行分离 课堂总结 气相色谱系统 记录仪 色谱 处理机 气体钢瓶 色谱主机 空气压缩机 气相色谱仪整机 气 相 色 谱 整 机 钢瓶与减压阀 氮气 氢气 气相色谱仪主机 控 温 柱 室 色 谱 电 路 控 制 气相色谱仪柱室 控 温 柱 室 控温方式：恒温或程序控温 * （二）凝胶过滤介质 基本要求： 不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用 高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高 常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 1. 葡聚糖凝胶 应用最广泛的一类凝胶。 由葡聚糖Dextran交联而得。 在制备凝胶时添加不同比例的交联剂可得到交联度不同的凝胶。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫做交联度。 交联度大：网状结构紧密，吸水量小 交联度小：网状结构疏松，吸水量多 化学性质比较稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液 2. 琼脂糖凝胶 来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶， 不是共价交联，而是以氢键交联，键能较弱。 孔隙度通过改变琼脂糖浓度而达到（与葡聚糖不同） （联系琼脂糖凝胶电泳） 化学稳定性：琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 没有干胶，必须在溶胀状态保存。 能分离几万至几千万高相对分子质量的物质，分离范围随着凝胶浓度上升而下降，颗粒强度随浓度上升而提高。 适用于核酸、多糖和蛋白质类物质的分离。 3. 聚丙烯酰胺凝胶 人工合成，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。 对芳香族、杂环化合物有不同程度的吸附作用。 （三）操作方法 凝胶的预处理 层析柱的选择 凝胶柱的装填 样品处理和加样 洗脱与收集 凝胶的保存 1、凝胶的预处理：充分溶胀 2、层析柱的选择 ① 体积 ② 柱比：层析柱的长度与直径的比 （样品的数量、性质、分离目的） 3、凝胶柱的装填 进胶过程宜连续、均匀、不中断，并不断搅拌。 4、样品处理和加样（样品的浓度、黏度） 5、洗脱与收集（洗脱液的成分、流速、目的物） 6、凝胶的保存（去除杂质） 六、高效液相色谱法 (High performance Liquid chromatography, HPLC) 高效液相色谱法： 特指一种以液体为流动相的色谱分离分析方法。它是在经典液相色谱的基础上，引入了气象色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 （一）HPLC的分类和基本原理 固定相 液-液色谱 液-固色谱 作用原理 液-固吸附色谱 液-液分配色谱 凝胶渗透或体积排除色谱 离子交换色谱 亲和色谱 1.液-固吸附色谱 流动相—液体 固定相—固体吸附剂（活性吸附剂） 分离机制： 被分离的组分分子（溶质分子）与流动相争夺吸附剂表面活性中心，