原生质体的分离、培养和融合.pptVIP

* 第九章 植物原生质体的分离、培养和融合 第一节 概述 一、概念 原生质体就是除去了细胞壁的裸露的球形细胞。 植物细胞与动物细胞不同，在细胞膜外有一层坚硬的纤维素组成的细胞壁。 由于这层细胞壁的存在，阻碍了细胞融合的发生和遗传物质的跨膜传递。 原生质体具有一切活细胞的特性，同时具有许多细胞完整细胞不具备的特点。这些特点和植物细胞全能性结合起来，使植物原生质体在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。 二、植物原生质体是体细胞遗传学研究的重要实验系统 1、去除了细胞壁，使它能容易地摄取外来遗传物质，如DNA，染色体、病毒、细胞器等，为细胞水平和分子水平的遗传操作提供了实验系统。 2、植物原生质体可以自发地或被诱导产生细胞融合，为体细胞杂交提供了实验材料。 3、植物原生质体也具有细胞的全能性，为植物诱变育种提供了实验材料。 4、利用植物的原生质体可以非常容易地分离各种细胞器，用于各种遗传操作。 5、研究细胞膜的功能（信息传递、能量转换、物质运输等） 所以，植物原生质体是体细胞遗传学研究的重要实验系统，正在越来越为研究者所重视。 第二节 植物原生质体的分离 一、原生质体的分离方法 1、细胞壁的组成： 纤维素、半纤维素、果胶质和少量的蛋白。 2、技术关键： 去除细胞壁，又不损伤原生质体。 3、分离方法 A：机械法分离： 利用高渗的糖液，使细胞发生质壁分离，然后利用利刃切割。 机械分离法的适宜的材料：高度液泡化的细胞（组织）。 机械分离法的限制： ①得到的原生质体有限。 ②只限于能够广泛发生质壁分离的组织。 ③不能从成熟的和分生细胞分离原生质体。 B：酶解法分离： 1960年，英国的Cocking首先利用纤维素酶制备了番茄的原生质体，证实了利用酶解法制备大量原生质体的可能性。 直到1968年在纤维素酶和离析酶投入市场化生产后，原生质体的研究才成为一个热门领域。 酶解法的优点： ①能够容易地大量地得到原生质体 ②条件温和，完整性好，有活力。 ③几乎可以从任何组织（只要细胞还没有木质化）分离出原生质体。 现在为常规方法。 二、酶解法的材料来源 1、叶肉细胞 取材方便，供应及时，细胞排列疏松，易于酶解液的处理，有叶绿素标记。 温室生长的植物，叶片干净幼嫩，是较好的材料来源。 无菌苗的叶片更具优势。 2、悬浮培养的细胞或愈伤组织 由禾本科的植物叶片获得适于培养的原生质体是相当困难的，可以利用培养细胞制备原生质体。 有些悬浮培养的细胞，细胞壁难以用目前的酶制剂降解，可以在培养基中加入生长素、含硫氨基酸、还原剂或重金属离子培养细胞，有时可以改变细胞壁的组成。 生长素对细胞壁的可塑性和延长是一个重要的影响因子，含硫氨基酸和还原剂可以影响细胞壁的双硫键，对细胞壁的降解有利。 经常进行继代培养的细胞、或培养基中蔗糖浓度较低的悬浮培养细胞，分离原生质体时的得率高，细胞碎片少。 三、原生质体的分离步骤 （一）取材（叶肉细胞） 充分展开的嫩叶。 洗涤、消毒、无菌水冲洗。 对禾本科植物叶片消毒时，使用苄烷铵（Zephiran）（0.1%） - 酒精（10%）溶液漂洗5分钟效果最好。 （二）酶解 原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度。 纤维素酶主要分解细胞壁纤维素。 果胶酶（非常好离析酶）主要降解细胞壁间的中胶层。 有些组织在制备原生质体时，可能还会需要半纤维素酶。 酶解液的组成 酶的混合液： 纤维素酶（1-2% 浓度）、果胶酶（0.2- 0.5%浓度）等。 渗透稳定剂： 促进酶解，保持原生质体的完整性。 甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等， 适宜的浓度为450-800 m mol/L。 盐类 氯化钙 50 -100m mol/l，磷酸二氢钾(0.7m mol/l)等。 增加膜的透性。 以盐类调节培养基的渗透压对原生质体往往是有害的。 酶解 材料→ 撕掉下表皮→ -修剪成2cm见方小块 → 置于6cm直径培养皿中(下表面朝下0.5g) → 加2ml酶解液→置于25-27°C下保持3-4小时左右--轻轻震荡—原生质体释出。 3、影响酶活性和酶解效果的因素 纯度：纯化的酶活性可能降低 PH值：4.7-6.0之间 温度：酶活性的最适温度40-50℃，植物所需温度为25-30 ℃ 时间：30分钟-20小时 用量：1g鲜组织用10ml酶解液的效果很好。 刚游离出来的叶肉原生质体 四、原生质体的纯化 酶解后的混合物中将含有完整的原生质体、亚细胞碎屑（叶绿体、维管成分）、未被消化的细胞等，因而必须将这些杂质除去。 初步筛选：利用50-70μm孔径的镍丝网过滤混合物，收集滤出液，做进一步的纯化。 1、沉降法： 将上述滤