39-硕士研究生课-现代分子生物学-核酸研究进展-1-李恩民要点.pptVIP

两个问题：反转录PCR实验是否需要探针 ？反转录PCR的特异性如何保证 ？ 核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）是一种 较好的mRNA定量检测技术。 RPA的各项实验指标均优于Northern Blotting。 运用RPA可实现对目标RNA分子的高通量定量检测。 原理： 以目标基因DNA为模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放射法）作为标记信号，体外转录合成反义RNA探针。 将过量的反义RNA探针与样品总RNA杂交，然后进行核糖核酸酶处理。未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解，而目标RNA则因与探针结合形成双链而被‘保护’。 杂交双链进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射自显影或化学发光等方法确定目标RNA的量。 适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别 常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性定量或半定量分析 适时荧光定量PCR技术：通过一个特殊的荧光探针，对PCR扩增反应中每一次循环的产物进行适时跟踪定量分析 real time PCR 的扩增曲线 Ct值极具重现性 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号值与模板数成正比 固定荧光信号值后，循环数与初始模板数成反比。初始模板数越多, 荧光信号达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板浓度的对数与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的初始模板数。 常用的定量PCR荧光探针 SYBR Green I Taqman水解探针 分子信标 SYBR Green I 结合到双链DNA的小沟部位 只有和双链DNA结合后才发荧光 SYBR Green I 工作原理 SYBR Green I的优点 价格相对便宜 使用简便 可以用于不同的模板 灵敏度很高 SYBR Green I的缺点 特异性较差 TaqMan Probes的优点： 定量关系准确。随着扩增循环数增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团成倍增加，荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 TaqMan探针特别适合于病毒定量、基因转录水平定量、癌细胞基因微突变检测等。 敏感性高。 特异性高。 TaqMan Probes的缺点： 只适合于一个特定目标的检测。 分子信标优点： 分子信标能特异性地检测目标DNA 分子信标可用于单核苷酸多态性的检测 特别适用于检测点突变 分子信标的缺点 只能用于一个特定的目标 设计困难 价格较高 ABI Prism 7700 可以在同一反应体系中同时对多个靶DNA或cDNA分子进行扩增检测 一次可以测定96个样本 速度较快，一批样本的完成只需要2～3小时 可应用水解探针、双链DNA结合染料和分子信标等 不能实时对扩增结果进行分析，只能在全部扩增结束后再进行数据分析 核酸实验研究技术进展－1 PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图 核酸实验研究技术进展－1 Threshold 104 103 102 核酸实验研究技术进展－1 核酸实验研究技术进展－1 核酸实验研究技术进展－1 未结合的SYBR green I 核酸实验研究技术进展－1 核酸实验研究技术进展－1 TaqMan Probes 荧光素 淬灭剂 与目标序列互补 FAM TET JOE HEX VIC TAMRA DABCYL 核酸实验研究技术进展－1 TaqMan Probes工作原理 探针与目标序列配对 ，荧光基团与荧光淬灭剂相邻，不发生特异荧光 光 能量转移 Taq 游离的探针 荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，荧光基团与荧光淬灭剂分离，发出特异荧光。 Taq 发出特异荧光 光 另一波长的荧光 核酸实验研究技术进展－1 核酸实验研究技术进展－1 分子信标 (发夹型杂交探针) 荧光基团 茎由互补配对的序列组成 环与目标序列互补 淬灭剂 茎(5-7bp) 环（15-30bp） FAM Texas Red 核酸实验研究技术进展－1 分子信标工作原理 探针与DNA模板杂交 光 发出荧光 荧光基团 单链DNA 模板 淬灭剂 茎 环 光 ＋ 核酸实验研究技术进展－1 核酸实验研究技术进展－1 核酸实验研究技术进展－1 * 生物系统中mRNA或DNA等目标核酸分子的分析鉴定 必须回答如下三个基本问题： 目标核酸分子是否存在于实验标本中。 实验标本中目标核酸分子的含量是多少。 实验标本中目标核酸分子的序列如何；以及与其他实验标本中的情况比较，目标核酸分子的序列是否有变化。 核酸实验研究技术进展－1 证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法： 1）杂交法，2）PCR法，3）测序法。 核酸实验研究技术进展－1 杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的