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第六讲免疫荧光组化技术 主要内容 一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜 七、非特异性荧光的消除方法 八、激光扫描共聚焦显微镜 思考题： 1.什么叫荧光？ 2.常用荧光素有哪些特征？ 3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备方法？ 4.免疫荧光组化直接法、间接法的 原理和主要操作流程？ 5.观察荧光组化片时应注意哪些问题？ 6.非特异性荧光的消除方法有哪几种？ 一、荧光的特征 分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。 激发 当电子吸收能量跃迁到较高能级， 这个过程叫激发。发射 以辐身方式跃迁时，能量转化成相 应波长的光，这个过程叫发射。 荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。 二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。 1、具备用于标记抗体的荧光素条件(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其降解产物易排除。 (2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量下降不多。(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化 性质无影响。(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。 2.荧光素的种类(1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量390D，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm。呈现明亮的黄绿色荧光，分子量389.4。 (2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。 (3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596～600nm，呈明亮橙红色荧光，分子量580，RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。 (4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯(5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）(6)得克萨斯红（Texas red）(7)藻红蛋白（PE）(8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5） 三、荧光素标记抗体的方法(一)FITC标记抗体的方法 1.Marsshall法(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸ε -氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。 (2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总 量的1/10。荧光素的准备：用分析天平准确称取 0.01mgFITC/1mg抗体。结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体 溶液中。 透析 过柱 Sephade×G50或 G25 保存 4℃ -40℃等量甘油分装保存。2.Chadwick法3.改良法4.透析标记法（二）四乙基罗达明标记抗体方法（三）藻红蛋白标记抗体方法 四、荧光抗体的质量控制主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。1.特异性染色效价测定2.非特异性染色测定3.吸收试验4.F/P比值的测定方法 五、免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法 简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。 (2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。(3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。(4)pH9.0缓冲甘油封片。(5)镜检 2.间接法 是直接的重要改进，先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结合。 操作流程 (1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS洗3×3min。(2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h，或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。 (3)荧光标记二抗适当稀释37℃ 30mi