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第十二章荧光分析法（Fluorometry） 分子荧光 Molecular fluorometry 内容预览 第一节 基本原理 第二节 定量分析方法 第三节 荧光分析条件的选择 第四节 荧光分光光度计和荧光分析新技术 第一节 基本原理 光致发光： 物质吸收能量（电、热、化学和光能等）后电子会从基态能级被激发至激发态能级，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为光致发光。 常见的光致发光是荧光和磷光。 荧光：物质从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光辐射。 分子荧光和原子荧光：待测物为分子、原子 种类：紫外可见荧光、红外荧光、X射线荧光 一、分子荧光的产生与荧光光谱 1. 分子荧光的产生机制 荧光和磷光产生示意图 2. 去活化过程（Deactivation） 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态 。这些过程包括： （1）振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR） 处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，电子从高振动能层失活至同一电子能级内低振动能层的过程，称为振动弛豫。 （2）内转换（Internal Conversion，IC） 较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动偶合产生无辐射跃迁。 去活化过程的归纳总结 3. 荧光激发光谱和荧光发射光谱 任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱（荧光光谱）。是定性分析的基础。 （1）荧光激发光谱（excitation spectrum） 改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射波长处的强度变化，以激发波长λex对荧光强度 F 作图得激发光谱。 激发光谱形状与吸收光谱形状十分相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。 二、荧光与分子结构的关系 1、荧光寿命： 去除激发光源后，分子荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，用τf 表示。 根据指数衰减定律可求出荧光寿命： 2、荧光效率（fluorescence efficiency) ※ 3、荧光产生的条件 产生并可观察到荧光的条件： 1）分子必须具有吸收一定频率紫外光的特定结构； 2）物质吸收特征频率的辐射后，必须具有较高的荧光效率 4、产生荧光的结构因素 （1）长共轭结构： 共轭效应：共轭度越大，荧光效率与大，荧光越强，荧光光谱红移。（与紫外﹣可见光谱规律类似） （2）刚性平面结构： 分子刚性（Rigidity）和平面性越大，分子振动越少，系间跨越和碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，光谱红移。 分析并解释下列事实 （3）苯环上的取代基： 给电子取代基： 增强荧光（p–π共轭），如—OH、—OR、 — NH2、 — CN、 — NR2等； 吸电子取代基： 减弱或破坏荧光，—COOH、 — C=O、 —NO2、 — NO、 — X等； 卤素取代基随原子序数增加荧光逐渐减弱，磷光逐渐增强，该现象也称重原子效应。 与π键作用较小的取代基： 对荧光影响不明显。—SO3H、—NH3+ （4）荧光试剂： 指与弱荧光物质作用得到强荧光物质的化合物。 常用荧光试剂： 荧光胺：用于脂肪或芳香伯胺 邻苯二甲醛：用于伯胺、氨基酸 丹酰氯：伯、仲胺，酚基生物碱 测定无机离子的荧光试剂：与无机离子形成共轭有机配合物 5、影响荧光产生的外部因素 （1）溶剂效应： ① 一般，溶剂极性增大荧光强度增加并红移； ②溶剂粘度降低，荧光强度减弱。 ③因溶剂而形成氢键、电离等作用而改变荧光物质结构会使荧光波长和强度改变。如重原子溶剂使荧光减弱 （2）温度： 温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加，粘度或“刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。 （3）pH值： 在不同pH值时，具酸或碱性基团的有机物结构可能发生变化；无机荧光物质，影响其稳定性。 （4）荧光猝灭与猝灭剂： 指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。 猝灭剂：如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等吸电子极性物质。 猝灭形式： ?碰撞猝灭；?转化为物荧光物质；?转入三重态的猝灭，引入溴、碘、氧；?电子转移猝灭；?浓度较大产生自猝灭。 荧光猝灭法: 若加入猝灭剂后，其荧光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，则可据此测定荧光猝灭剂的含量，这种方法称为荧光猝灭法。 （5）散射光： 瑞利光：与物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换只改变方向的散射光。 拉曼光：与物质分子发生非弹性碰撞，既有能量交换又改变方向的散射光。 干扰及消除