04电泳的程序.pptVIP

5电泳的操作模式 目前最常用的电泳操作模式是区带电泳中的聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳，前者主要用于蛋白质的分离鉴定，后者主要于核酸的分析鉴定。电泳的操作模式有按操作方式和分离原理分类。 5.1按电泳方式分类 (1)端电极电泳：有垂直式和水平式两种方式，多用于蛋白质电泳。 (2)搭桥电泳：为水平式，水平板状电泳槽形式多样，凝胶和缓冲液通过间接接触的方式，如用滤纸桥搭接，用缓冲液制作的凝胶条或滤纸条搭接（图3-4），后两者即半干技术，多用于免疫电泳、等电聚焦。 A B C 图4 水平板状电泳中凝胶与缓冲液的接触方式 A 滤纸桥 B 凝胶条 C 滤纸条 (3)潜水电泳： 为水平式，电泳时凝胶浸于缓冲液中，多用于核酸电泳。 5.2按分离原理分类 (1)净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳； (2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳； (3)聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳； (4)聚丙烯酰胺凝胶双向电泳； (5)聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦； (6)聚丙烯酰胺凝胶转移印迹电泳； (7)琼脂糖凝胶水平电泳； (8)琼脂糖凝胶脉冲电泳； (9)琼脂糖凝胶免疫电泳。 6凝胶电泳的支持介质 6.1支持介质的性质 采用支持介质进行电泳的目的是防止在电泳过程中分子的对流和扩散，使被分离物质得到更有效的分离。支持介质应当具备以下特性： (1)物理化学性质稳定：在电泳过程中不受环境因素的影响，保持原有的状态和性能。 (2)化学惰性：在电泳过程中不与缓冲系统中的各种离子和待分离的生物大分子发生化学反应，不干扰生物大分子的电泳过程。 (3)分布均匀：内电渗小，结果重复性好 6.2支持介质的分类 电泳的固体支持介质可以分为两类: (1)薄膜类： 薄膜类包括纸类，醋酸纤维素薄膜，聚酰胺薄膜等. 这类支持介质化学惰性好，在电泳过程中产生的对流和扩散较小，分离的基本原理主要是基于生物大分子的电荷密度。 (2)凝胶类：凝胶类包括淀粉凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。 这类介质相对薄膜类又了进一步，它具有高粘度和高摩擦阻力，它在电泳过程中不仅能防止对流，减小扩散，还具有凝胶的多孔性，孔径与蛋白质分子大小大致相同，因而能产生分子筛效应(molecular sieving effect)，其分离作用既与电荷密度有关，又与分子大小有关，因而凝胶的分离原理是基于大分子的电荷密度和分子大小，对分离不同相对分子质量的生物大分子极为有利。所以，生物大分子如蛋白质和核酸电泳多采用凝胶类介质。淀粉凝胶由于质量难以控制，操作繁琐，分辨率低，实验室中已很少使用，现在用得最多的是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。 7凝胶支持介质 7.1聚丙烯酰胺凝胶 7.1.1聚丙烯酰胺凝胶的特性 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体(monomer)丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-甲叉双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacrylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophorsis，简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶用于电泳的支持介质，与其它凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶具有以下优点： (1)孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，具有良好的分子筛效应。根据待分离大分子的相对分子质量，通过改变凝胶浓度及交联剂度来调节凝胶的孔径，使大分子得到较好的分离。 (2)在一定浓度范围内，凝胶透明，有弹性，机械性能好 (3)凝胶是由—C—C—C—C—结合的酰胺类多聚物，侧链上具有不活泼的酰胺基，没有其它带电基团，所以凝胶性能稳定，电渗作用小，无吸附，化学惰性强。与生物大分子不发生化学反应，电泳过程中不受温度、pH的变化的影响。 (4)具有高分辨率和灵敏度，尤其是在不连续电泳系统中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，样品不易扩散。并有多种染色方法提高电泳条带显色的灵敏度，分离蛋白质的灵敏度可达10-6g。 (5)单体纯度高，在相同的实验条件下，电泳结果具有很好的重复性。 (6)凝胶杂质少，在很多溶剂中不溶，可适用于少量样品的制备，不致污染样品。 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物发展起来的电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳、等电聚焦及双向电泳等电泳技术，不仅能分离、小量制备生物大分子，而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。 7.1.2聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(fr