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第六章 DNA重组技术 第六章 DNA重组技术 DNA重组（DNA recombination） 不同来源的DNA，通过磷酸二酯键连接而重 新组合成新的DNA分子的过程。 第六章 DNA重组技术 DNA克隆（DNA clone） 在体外对DNA分子进行重组，构建成具有自主复制能力的重组DNA分子，再导入宿主细胞进行大量扩增，最终获得大量同一的DNA分子 亦称分子克隆或DNA重组技术 第一节 常用的工具酶 第一节 常用的工具酶 工具酶： DNA重组技术，需要利用一些酶在体外对 DNA进行切割、连接等基因操作，这些酶常被 称为工具酶。 主要的工具酶: 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 逆转录酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 第一节 常用的工具酶 一、限制性内切酶 一、限制性内切酶 （一）分类 根据酶的分子组成及裂解方式的不同，将限制 性内切酶分为三类： 1.Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶 一、限制性内切酶 2.Ⅱ类限制性内切酶 能识别并切割特异性的核苷酸序列 通常所说的限制性内切酶即指此类 （二）命名 通常由三个斜体字母表示 1.第一个大写字母为微生物属名的第一个字母 2.第二、三个小写字母为微生物种名的头两个字母 3.如有株名则再加一个字母 一、限制性内切酶 4.同一株微生物发现几种限制性内切酶，根据 其发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示 例如: 淀粉液化芽胞杆菌 （Bacillus amyloliguefaciens）H株 第1种限制性内切酶，命名为BamHⅠ （四）限制性内切酶的应用 主要应用： DNA重组克隆及亚克隆 改造和构建质粒 组建基因组DNA物理图谱 基因组DNA同源性研究 DNA杂交 DNA序列分析 1.酶活力单位 在合适温度、pH值和离子强度等条件下，1小 时内完全消化1μg特异DNA底物所需的酶量，定义 为一个活力单位。 2.星号活性 限制性内切酶在非标准反应条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，一般在酶的右上角加 “*” 表示 克隆过程中需同时进行双酶切时，应选用二种酶都能接受的反应缓冲体系，否则可能影响酶的特异性 3.注意事项 底物DNA不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚 溶液中不能含SDS和过量的盐， EDTA的含量不能大于10mmol/L 反应缓冲体系中一般可加入2-巯基乙醇或二硫苏糖醇，防止含巯基酶的氧化失活 加入牛血清白蛋白稳定酶活性 操作时应注意混匀反应体系 一、限制性内切酶 (六) 甲基化酶 1.细菌的限制－修饰系统 限制（降解）外来DNA，并通过对自身DNA的 修饰而起保护作用。 一、限制性内切酶 2.Ⅱ类限制－修饰系统 由两种酶分子组成的二元系统 一种为限制性内切酶，另一种为甲基化酶 两种酶识别序列相同 大肠杆菌株一般有dam甲基化酶和dcm甲基化酶 （PstⅠ甲基化酶使A甲基化形成5′-CTGCmAG-3′） 3.甲基化酶的应用 当制备克隆用双链cDNA时，外源DNA片段可用 EcoR Ⅰ甲基化酶处理，使双链cDNA内部 EcoR Ⅰ 位点因甲基化受到保护而不被切割 二、DNA连接酶 催化双链DNA中相互邻近的5′磷酸末端和3′ 羟基末端生成磷酸二酯键，从而封闭DNA双链中 的切口或将二个DNA分子连接起来。 二、DNA连接酶 DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接 DNA连接酶是重要的基因重组的工具酶 应用DNA连接酶将具有相同粘性末端或平端 的DNA分子连接起来 二、DNA连接酶 DNA连接酶的特点： T4噬菌体DNA连接酶能连接带粘性末端或平末端的DNA分子 大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端 DNA分子 DNA重组技术常用T4噬菌体DNA连接酶 二、DNA连接酶 T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子 连接反应需要ATP、Mg2+ 和二硫苏糖醇，最适pH为7.2～7.4，ATP为连接反应提供能量，二硫苏糖醇可提高连接效率 三、分子克隆中常用的其他酶 1.逆转录酶 以RNA为模板逆转录合成cDNA 2.Taq DNA聚合酶 PCR扩增目的DNA片段 DNA序列分析 目的DNA片段3′端加A，用于A－T克隆 三、分子克隆中常用的其他酶 3.T4多核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′端羟基磷酸化 标记探针5′端 4.末端转移酶（脱氧核苷酸末端转移酶） DNA片段3′端加上同聚物尾 标记DN